本发明专利技术公开了一种具有α‑葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽，寡肽的缩写为AVPANLVDLNVPALLK，分子量1647.8Da，所述寡肽的氨基酸序列为Ala‑Val‑Pro‑Ala‑Asn‑Leu‑Val‑Asp‑Leu‑Asn‑Val‑Pro‑Ala‑Leu‑Leu‑Lys，所述寡肽可以从黑茶千两茶中分离得到，也可以使用固相合成仪合成得到，能够实现体外降血糖的效果，可应用于保健食品、特殊医学用途配方食品与生物制药领域，改善糖尿病病人的病症，本发明专利技术还公布了所述寡肽的制备方法、含有该寡肽的药品组合物、含有该寡肽的保健品和含有该寡肽的食品。
An oligopeptide with \u03b1 - glucosidase inhibitory activity and its application
【技术实现步骤摘要】
一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽及其应用
本专利技术涉及生物制药领域，特别是一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽，本专利技术还涉及该寡肽的制备方法和应用。
技术介绍
糖尿病的早期征兆往往是餐后高血糖，特别是2型糖尿病病人,，餐后高血糖不仅极易诱发各种并发症，还会极大地提高糖尿病的死亡率，而α-葡萄糖苷酶位于小肠刷状缘膜上皮细胞,它能将双糖,如蔗糖、麦芽糖等水解成可被小肠吸收的单糖，从而导致血糖升高，因此,抑制α-葡萄糖苷酶能够延缓碳水化合物的消化,减少葡萄糖吸收入血,进而控制餐后血糖浓度的升高。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类新型的降血糖药物，它可通过抑制小肠刷状缘细胞表面的α-葡萄糖苷酶活性，减缓葡萄糖的生成及吸收，同时增加肝脏及周围组织对胰岛素的敏感性，减少高血糖对胰腺刺激，从而起到降低血糖浓度糖及治疗糖尿病的目的。虽然,合成的α-葡萄糖苷酶抑制药物已经上市(如阿卡波糖等),但由于它们有一定的毒副作用,因此从植物中筛选天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有广阔的前景。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽及其应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽，所述寡肽的氨基酸序列为Ala-Val-Pro-Ala-Asn-Leu-Val-Asp-Leu-Asn-Val-Pro-Ala-Leu-Leu-Lys，所述寡肽的缩写为AVPANLVDLNVPALLK，分子量1647.8Da。所述寡肽可以从黑茶千两茶中分离得到。具体包括如下步骤：(1)茶蛋白提取：将千两茶叶粉碎后过20-40目筛，以料液比为1:5-40的比例混合茶粉和超纯水，于95℃加热浸提10-60min，浸提液过滤后在25℃，8000rpm/min的条件下离心20min，收集上清液，往上清液中加入饱和硫酸铵溶液(上清液:硫酸铵＝1:2-6)，在4℃静置12h，使蛋白质沉淀，然后，于4℃，6000rpm/min条件下离心20min，取沉淀，用超纯水溶解，在室温中透析24小时，以去除硫酸铵等小分子物质，获得千两茶粗蛋白；(2)粗蛋白的酶解：将步骤(1)制得的千两茶粗蛋白样品制成2-10mg/mL的溶液，于50℃水浴中保持10min，用浓度为2.0mol/L的氢氧化钠调节PH至8.0，以酶/底物比(E/S)为1-5％(w/w)的比例添加胰蛋白酶，酶解时间为5-10h，酶解过程中用浓度为2.0mol/L的氢氧化钠溶液调节酸碱度，使其保持在pH8.0，酶解完成后把样品置于95℃下加热20min使酶灭活，并于4℃，8000rpm/min离心10min，弃去沉淀，制得千两茶胰蛋白酶酶解组分，冻干备用；(3)“酶-抑制肽”复合物的制备：取所述千两茶胰蛋白酶酶解组分配成1-5mg/mL样品溶液，将α-葡萄糖苷酶溶解在10mMpH6.8磷酸盐缓冲液中配成10U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，再取50-300μL所述样品溶液与100-500μL所述α-葡萄糖苷酶溶液混合，于37℃下，摇床培养10-60min，使酶与抑制剂样品充分结合；(4)未与酶结合成分的去除：培养结束后，把步骤(3)制得的混合物加入截留分子量为30kDa的超滤离心管中，并于常温下，10000rpm/min离心25min，去除样品中未与酶结合的成分，用200μL磷酸缓冲洗截留后的滤液3次，并于常温下，5000rpm/min离心5min；(5)抑制肽的释放、分离与鉴定：离心后往上层(即“酶-抑制肽”复合物层)液体中加入100-400μL50％乙腈水溶液，混合均匀，静置10min之后，在常温下以10000rpm/min离心10分钟，重复2次，合并滤出液，过0.22μm超滤膜，制得千两茶超滤液，进行高效液相谱分离，收集合适的峰，即获得所述具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽。所述寡肽也可以使用固相合成仪合成制得，也就是说，将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键，不断重复这一过程，合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。一种药物组合物，所述药物组合物含有上述的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽。一种保健品，所述保健品含有上述的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽。一种食品，所述食品含有上述的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽。所述寡肽在浓度为2mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶的体外抑制率为94.3％。所述寡肽在浓度为1.5mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶的体外抑制率为84.6％。所述寡肽对α-葡萄糖苷酶的50％抑制浓度(IC50)为1.0261±0.12mg/mL。本专利技术的有益效果是：可以从黑茶千两茶提取出一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽，能够实现体外降血糖的效果，可应用于保健食品、特殊医学用途配方食品与生物制药领域，改善糖尿病病人的病症。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。图1是实施例1所述千两茶超滤液的高效液相色谱图；图2是实施例1所述寡肽的一级质谱图；图3是实施例1所述寡肽的二级质谱图；图4是实施例1所述寡肽的离子碎片分析图；图5是实施例2所述寡肽的高效液相色谱图；图6是实施例2所述寡肽的质谱图；图7是本专利技术所述寡肽与阿卡波糖的“浓度-抑制率”折线图。具体实施方式实施例1：一种制备具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽的方法，包括如下步骤：(1)茶蛋白提取：将千两茶叶粉碎后过20目筛，以料液比为1:20的比例混合茶粉和超纯水，于95℃加热浸提30min，浸提液过滤后在25℃，8000rpm/min的条件下离心20min，收集上清液，往上清液中加入饱和硫酸铵溶液(上清液:硫酸铵＝1:4)，在4℃静置12h，使蛋白质沉淀，然后，于4℃，6000rpm/min条件下离心20min，取沉淀，用超纯水溶解，在室温中透析24小时，以去除硫酸铵等小分子物质，获得千两茶粗蛋白；(2)粗蛋白的酶解：将步骤(1)制得的千两茶粗蛋白样品制成5mg/mL的溶液，于50℃水浴中保持10min，用浓度为2.0mol/L的氢氧化钠调节PH至8.0，以酶/底物比(E/S)为1.5％(w/w)的比例添加胰蛋白酶，酶解时间为6h，酶解过程中用浓度为2.0mol/L的氢氧化钠溶液调节酸碱度，使其保持在pH8.0，酶解完成后把样品置于95℃下加热20min使酶灭活，并于4℃，8000rpm/min离心10min，弃去沉淀，制得千两茶胰蛋白酶酶解组分，冻干备用；(3)“酶-抑制肽”复合物的制备：取千两茶胰蛋白酶酶解组分配成2mg/mL样品溶液，将α-葡萄糖苷酶溶解在10mMpH6.8磷酸盐缓冲液中配成10U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，再取100μL所述样品溶液与200μL所述α-葡萄本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽，其特征在于所述寡肽的缩写为AVPANLVDLNVPALLK，所述寡肽的氨基酸序列为Ala-Val-Pro-Ala-Asn-Leu-Val-Asp-Leu-Asn-Val-Pro-Ala-Leu-Leu-Lys。/n
【技术特征摘要】
1.一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽，其特征在于所述寡肽的缩写为AVPANLVDLNVPALLK，所述寡肽的氨基酸序列为Ala-Val-Pro-Ala-Asn-Leu-Val-Asp-Leu-Asn-Val-Pro-Ala-Leu-Leu-Lys。
2.根据权利要求1所述的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽，其特征在于所述寡肽可以从黑茶千两茶中分离得到。
3.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物含有权利要求1或2所述的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽。
4.一种保健品，其特征在于所述保健品含有权利要求1或2所述的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽。
5.一种食品，其特征在于所述食品含有权利要求1或2...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐伟，刘欣杰，陈燕衡，周建波，
申请(专利权)人：中慈保健品科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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