一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，及其筛选方法以及应用技术

本发明专利技术提供一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，及其筛选方法以及应用，其中，该特异性结合肽的筛选方法包括以下步骤：1)在孔板内制备聚己内酯涂层；2)采用噬菌体展示技术利用步骤1)制备的具有聚己内酯涂层的孔板筛选出两条特异性结合肽；以及3)采用聚己内酯纳米颗粒对步骤2)获得的两条特异性结合肽进行验证。本发明专利技术通过筛选获得聚己内酯纳米颗粒的两条特异性结合肽，该特异性结合肽的多肽序列分别为：DGSMLNRMRGFS，YALGRPSLQGPN，该特异性结合肽可与多肽、蛋白等生物分子进行偶联，有望为复杂环境中智能纳米传感器的构建提供新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，及其筛选方法以及应用
本专利技术涉及荧光纳米光极领域，更具体地涉及一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，及其筛选方法以及应用。
技术介绍
荧光纳米光极是基于电化学传感理论发展而来的一类光学传感器，此前已实现对钾、钠、钙等一系列离子进行浓度检测，成功用于环境监测等领域。传统的离子选择性纳米光极通常以增塑剂(如癸二酸二异辛酯，DOS)和塑化的聚氯乙烯(PVC)作为膜基质材料，以离子交换剂、离子载体和亲脂性pH指示剂(生色离子载体)作为传感组分，利用离子载体特异性识别待检测离子，根据pH指示剂的质子化程度反映待检测离子的浓度。通过改变其传感组件的种类及配比，纳米光极不仅可以对特定离子进行专一精确的测定，而且可以根据生理环境的离子浓度范围进行相应调整。这一优势为监测影响单细胞内信号通路的离子时空动态，深入了解它们的生物学功能提供了重要的研究手段。研究报道发现，使用PVC制备的钾离子选择性光极可成功测定正常心肌细胞发生动作电位时膜外钾离子浓度的变化。江德臣等研究者利用制备的钙选择性纳米光极传感器实现了对HeLa细胞内钙离子浓度波动的连续监测；之后通过在纳米光极表面修饰线粒体靶向的化学小分子三苯基膦(TPP)，利用荧光寿命分辨技术实现了对活细胞内线粒体以及溶酶体中游离钙离子水平的成功监测。然而由于传统的膜基质材料聚氯乙烯(PVC)和增塑剂存在潜在的致癌风险，并且生物相容性差，限制了光极传感技术在活细胞中亚细胞尺度离子通道的研究。此外，纳米光极界面修饰的细胞器定位的化学小分子也容易造成细胞器膜形态的损伤，增加对细胞的毒性。而细胞器靶向肽是对特定的细胞器具有靶向效果的一类生物小分子，相对于化学分子而言，其生物相容性更高，种类更多，并可和多种纳米粒子进行结合从而将其定位到目的细胞器中。除此之外还可以与其他生物功能分子，如多肽、蛋白进行偶联，赋予其更多的生物学功能。因此，开发生物相容性高、可生物降解的荧光纳米光极有望实现单细胞内活性离子的高时空分辨监测，具有重要的研究意义。聚己内酯(Polycaprolactone)，简称PCL，是一种半结晶型疏水性脂肪族聚酯。该聚合物易被水解，产物可以通过三羧酸循环被代谢或是通过肾脏分泌物而被直接消除，由于其具有良好的生物相容性和生物可降解性，目前已经被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于医疗及药物控释体系中，可用作细胞生长支持材料、骨组织生长支架以及完全可降解塑料手术缝合线。除此之外，该聚合物的玻璃转化温度为-60℃，熔点为60℃，具有极大的伸展性，可在低温下成型。有研究发现，由PCL制成的纳米颗粒在缓冲体系中稳定长达140天，在脂肪酶的存在下可被快速降解。Clark的研究团队已报道成功发展了一种以PCL为基质，以柠檬酸酯为增塑剂的钠离子纳米光极，可替代传统的基于PVC的纳米光极传感器，为荧光纳米光极在活细胞中的应用提供了进一步的实验支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，及其筛选方法以及应用，从而解决现有技术中荧光纳米光极毒性高、存在潜在致癌风险、生物相容性差的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：根据本专利技术的第一方面，提供一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽的筛选方法，包括以下步骤：1)制备一种具有聚己内酯涂层的孔板；2)采用噬菌体展示技术利用步骤1)制备的具有聚己内酯涂层的孔板筛选出两条特异性结合肽；以及3)采用聚己内酯纳米颗粒对步骤2)获得的两条特异性结合肽进行验证。步骤1)具体包括：将聚己内酯与F127溶解于四氢呋喃中制备成溶液，再将该溶液转移到细胞培养板中，干燥，即得一种具有聚己内酯涂层的孔板。步骤3)具体包括：将聚己内酯与F127溶解于四氢呋喃中，再使用注射器将其注入匀速搅拌的水中，得到聚己内酯纳米颗粒悬浮液，通过酶联免疫吸附实验验证所述特异性结合肽对聚己内酯纳米颗粒的结合力。优选地，所述步骤1)和步骤3)中聚己内酯与F127的质量比为(5:1)～(3:1)。最优选地，聚己内酯与F127的质量比为4:1。根据本专利技术的一个优选方案，所述步骤3)中聚己内酯纳米颗粒的制备包括：以质量比4:1分别称取聚己内酯和F127，溶解于四氢呋喃中，采用注射器将其逐滴滴入以800～1200r/min的转速不断搅拌的超纯水中，即得一种均一的聚己内酯纳米颗粒。现有文献报道以PCL为基质做成的纳米颗粒都需要加入柠檬酸酯等增塑剂，而本专利技术首次成功制备了无需增塑剂的基于PCL的纳米颗粒，关键因素是加入了F127这样一种表面活性剂。PCL和F127的质量比最优选为4：1。由于转速与纳米颗粒的粒径相关，改变条件则必然会影响纳米颗粒的粒径等物理性质，上述方案即为专利技术人进行优化后获得本专利技术中展示的纳米颗粒的其中一种优选条件。所述步骤3)通过酶联免疫吸附实验验证所述特异性结合肽对聚己内酯纳米颗粒的结合力包括：将所述聚己内酯纳米颗粒对孔板进行包被，加入封阻液，后用TBST缓冲液快速洗板；将混有筛选得到的噬菌体的TBST缓冲液加入孔板中，温和摇动后弃去液体，每孔加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体，室温反应后洗板加入显色底物ABTS，室温反应；用酶标仪测定孔板405nm处每孔的吸光值，计算每条特异性结合肽对应的结合力。根据本专利技术的第二方面，提供一种根据上述筛选与鉴定方法获得的聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，所述特异性结合肽包括两条，其多肽序列分别为：DGSMLNRMRGFS，YALGRPSLQGPN。本专利技术通过酶联免疫吸附实验(ELISA)验证了这两条多肽对基于PCL纳米颗粒的结合力，结果如下：DGSMLNRMRGFS>YALGRPSLQGPN，其中DGSMLNRMRGFS的相对结合力(相对于原始噬菌体肽库而言)大于3，表明其是一条强有力的特异性结合肽。此外，两条序列中的DGSMLNRMRGFS的亲水性更强，等电点更高。该特异性结合肽可与多肽、蛋白等生物分子进行偶联，从而实现生物分子对基于PCL纳米颗粒的定向、高效自组装，避免了复杂的化学修饰改性产生的毒副作用，为构建单细胞内高空间分辨率的智能纳米传感器提供了新方法。根据本专利技术的第三方面，提供一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽在与聚己内酯材料结合中的应用。所述聚己内酯材料包括：聚己内酯纳米颗粒、聚己内酯纤维以及聚己内酯薄膜等等。根据本专利技术的第四方面，提供一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽在基于聚己内酯的荧光纳米光极中的应用。应当知晓的是，本专利技术中使用的噬菌体肽库购自NEB噬菌体展示十二肽库。该肽库是将随机的十二肽融合到M13噬菌体衣壳蛋白上，构成一个组合文库。其中包含大量的随机多肽，包括可能结合和不结合的多肽序列，通过洗板过程可以洗去未结合的多肽，保留结合多肽。荧光纳米光极是一类以离子选择性电化学传感器理论为基础的光学传感器，可在生理环境下实现对多种活性离子的检测。然而现有的用于细胞和亚细胞水平离子检测的荧光纳米光极通常是由增塑剂或塑化的聚氯乙烯作为传感膜基质，存在致癌的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)在孔板内制备聚己内酯涂层；/n2)采用噬菌体展示技术利用步骤1)制备的具有聚己内酯涂层的孔板筛选出两条特异性结合肽；以及/n3)采用聚己内酯纳米颗粒对步骤2)获得的两条特异性结合肽进行验证。/n

【技术特征摘要】
1.一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在孔板内制备聚己内酯涂层；
2)采用噬菌体展示技术利用步骤1)制备的具有聚己内酯涂层的孔板筛选出两条特异性结合肽；以及
3)采用聚己内酯纳米颗粒对步骤2)获得的两条特异性结合肽进行验证。


2.根据权利要求1所述的聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽的筛选方法，其特征在于，步骤1)具体包括：将聚己内酯与F127溶解于四氢呋喃中制备成溶液，再将该溶液滴涂到细胞培养板中，待溶剂挥发完后，即得一种具有聚己内酯涂层的孔板。


3.根据权利要求2所述的聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽的筛选方法，其特征在于，步骤3)具体包括：将聚己内酯与F127溶解于四氢呋喃中，再使用注射器将其注入匀速搅拌的水中，得到聚己内酯纳米颗粒悬浮液，通过酶联免疫吸附实验验证所述特异性结合肽对聚己内酯纳米颗...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玥伶，王平，高营营，燕蕊，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31