【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】构建核酸文库的方法和试剂盒相关文献的交叉引用本申请要求2017年04月26日提交的美国临时申请No.62/482,189的优先权，其内容通过全文引用并入本文。参考以电子方式提交的序列表随本文提交的电子提交序列表的内容，文件名为Library_SEQ_submit.txt，大小为192367字节和创建日期为2018年2月4日，通过全文引用并于本文。
本专利技术大体上涉及遗传分析领域，并且更具体地涉及用于构建核酸文库的方法和试剂盒。
技术介绍
近年来见证了下一代测序技术的快速发展和广泛应用。下一代测序通常涉及在测序之前从核酸样品构建核酸文库。当前构建DNA文库的方法通常包括在片段的3’末端和5’末端的每个衔接子连接之前，先对核酸序列进行切割以获得双链DNA片段，从而使得能够对每个单独的双链DNA片段进行测序。在此过程中，例如，由于样品制备过程中(诸如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品，或长时间存储(例如化石样品))积累的DNA分子受到破坏，DNA分子中存在单链段，这会带来一个巨大的问题，...
【技术保护点】
1.一种从含多个核酸序列的生物样品中构建DNA文库的方法，包括：/n由所述生物样品制备DNA样品，其中，所述DNA样品包括多个单链DNA分子，每个单链DNA分子具有去磷酸化的5’末端；/n将第一衔接子的第一链与所述多个单链DNA分子中的每一个的3’末端连接，其中，所述第一衔接子的第一链沿自其5’末端至其3’末端的方向包括磷酸基团、条形码序列和第一引物识别序列；以及/n针对连接至所述第一衔接子的第一链的所述多个单链DNA分子中的每一个合成互补链以获得与其对应的条形码化的双链DNA分子。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170406 US 62/482,1891.一种从含多个核酸序列的生物样品中构建DNA文库的方法，包括：
由所述生物样品制备DNA样品，其中，所述DNA样品包括多个单链DNA分子，每个单链DNA分子具有去磷酸化的5’末端；
将第一衔接子的第一链与所述多个单链DNA分子中的每一个的3’末端连接，其中，所述第一衔接子的第一链沿自其5’末端至其3’末端的方向包括磷酸基团、条形码序列和第一引物识别序列；以及
针对连接至所述第一衔接子的第一链的所述多个单链DNA分子中的每一个合成互补链以获得与其对应的条形码化的双链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述将第一衔接子的第一链与所述多个单链DNA分子中的每一个的3’末端连接中，所述条形码序列的长度为2-16nt。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品中的所述多个核酸序列包括多个DNA序列，并且所述由所述生物样品制备DNA样品包括：
进行去磷酸化反应和解离反应以获得多个单链DNA分子，每个单链DNA分子具有去磷酸化的5’末端。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述进行去磷酸反应和解离反应包括至少一个以下循环：
进行去磷酸反应；以及
进行解离反应。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述进行去磷酸反应和解离反应包括至少一个以下循环：
进行解离反应；以及
进行去磷酸反应。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，在所述进行去磷酸反应和解离反应之前，所述由所述生物样品制备DNA样品进一步包括：
将所述多个DNA序列剪切成多个DNA片段。
7.根据权利要求6的方法，其中，所述多个DNA片段中的每一个大小为约100-300bp。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述多个DNA片段中的每一个大小为约150bp。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品中的所述多个核酸序列包括多个RNA序列，并且所述由所述生物样品制备DNA样品包括：
处理所述生物样品从而获得多个cDNA分子，每个cDNA分子对应于多个RNA分子之一。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述处理所述生物样品从而获得多个cDNA分子包括：
使用oligo(dT)作为引物进行逆转录以获得对应于所述多个RNA分子中的每一个的cDNA序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，在所述使用oligo(dT)作为引物进行逆转录以获得对应于所述多个RNA分子中的每一个的cDNA序列之前，所述处理所述生物样品从而获得多个cDNA分子进一步包括：
在所述多个RNA分子的每一个的3’末端进行聚腺苷酸化。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述处理所述生物样品从而获得多个cDNA分子的步骤包括：
使用随机引物或序列特异性引物进行逆转录以获得对应于所述多个RNA分子中的每一个的cDNA序列。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一衔接子在其第一链的5’末端包括单链段，并且所述将第一衔接子的第一链与所述多个单链DNA分子中的每一个的3’末端连接包括：
通过单链DNA连接酶进行连接反应，以便将所述多个单链DNA分子中的每一个的3’末端连接至所述第一衔接子的第一链的5’末端。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述单链DNA连接酶包括CircLigaseI或CircLigaseII中的至少一种。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一衔接子进一步包括第二链，所述第二链包括在其5’末端的第一部分和在其3’末端的第二部分，其中，所述第二链的第一部分长度为至少1nt并与所述第一链的5’末端形成双链成对物，而所述第二部分长度为至少1nt并在所述第一衔接子中形成单链突出端，并且将所述第一衔接子的第一链的5’末端与所述多个单链DNA分子中的每一个的3’末端连接包括：
通过绷带链促进的DNA连接酶进行连接反应，以便将所述多个单链DNA分子中的每一个的3’末端与所述第一衔接子的第一链的5’末端连接。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述第二部分的长度为4-10nt。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第一衔接子包括一组衔接子，每个衔接子配置为使得其第二链的第二部分包含随机序列。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第一衔接子包括一个或更多个衔接子，每个衔接子配置为使得其第二链的第二部分包含特定序列。
19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述第一部分的长度为8-18nt。
20.根据权利要求15所述的方法，其中，所述绷带链促进的DNA连接酶包括T3DNA连接酶、T4DNA连接酶、T7DNA连接酶或TaqDNA连接酶中的至少一种。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一衔接子的第一链进一步包括索引序列，其中：
所述索引序列在所述磷酸基团与所述条形码序列之间，或在所述条形码序列与所述第一引物识别序列之间；并且
所述索引序列配置成为连接至所述第一衔接子的第一链的所述多个单链DNA分子中的每一个提供索引信息。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述索引序列的长度为1-8nt。
23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一衔接子的第一链进一步包含分隔子序列，其中：
所述分隔子序列位于所述磷酸基团与所述条形码序列之间，并配置为用作所述条形码序列与连接至所述第一衔接子的第一链的多个单链DNA分子中的每一个之间的分隔标记物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述分隔子序列的长度为约2-16nt。
25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述分隔子序列进一步配置成为连接至所述第一衔接子的第一链的所述多个单链DNA分子中的每一个提供索引信息。
26.根据权利要求1所述的方法，其中，所述针对连接至所述第一衔接子的第一链的所述多个单链DNA分子中的每一个合成互补链以获得与其对应的条形码化的双链DNA分子包括：
使第一引物与连接至所述第一衔接子的第一链的所述多个单链DNA分子中的每一个退火，其中，所述第一引物包含与所述第一衔接子的第一链中的第一引物识别序列互补的序列；以及
进行单链延伸反应以针对连接至所述第一衔接子的第一链的所述多个单链DNA分子中的每一个形成双链DNA分子。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述使第一引物与连接至所述第一衔接子的第一链的所述多个单链DNA分子中的每一个退火包括：
缓慢地将反应温度从原始温度改变为所述单链延伸反应的工作温度。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述第一引物的Tm为约30-35℃，并且所述缓慢地将反应温度从原始温度改变为单链延伸反应的工作温度包括：
以不超过每分钟～1℃的速率将温度从不超过15℃的原始温度提高到所述单链延伸反应的工作温度。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述第一引物具有如SEQIDNO:914所示的序列。
30.根据权利要求26所述的方法，其中，所述针对连接至所述第一衔接子的第一链的所述多个单链DNA分子中的每一个合成互补链以获得与其对应的条形码化的双链DNA分子进一步包括：
对连接至所述第一衔接子的第一链的所述多个单链DNA分子中的每一个对应的所述双链DNA分子进行平末端修复。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述平末端修复是通过T4DNA聚合酶、Klenow片段或T4多核苷酸激酶中的至少一种进行的。
32.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一衔接子的第一链在其3’末端进一步包括固定部分，所述固定部分配置为能够形成与固体载体的稳定偶联，并且所述方法在将第一衔接子的第一链与所述多个单链DNA分子中的每一个的3’末端连接，与针对连接至所述第一衔接子的第一链的所述多个单链DNA分子中的每一个合成互补链以获得与其对应的条形码化的双链DNA分子之间，进一步包括：
通过所述固定部分与所述固体载体之间的所述稳定偶联，将连接至所述第一衔接子的第一链的所述多个单链DNA分子中的每一个固定至固体载体。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述固定部分包括第一偶联伴侣，所述第一偶联伴侣配置为能够稳定地结合至附着于所述固体载体的第二偶联伴侣。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述第一偶联伴侣包括生物素部分，所述第二偶联伴侣包括链霉亲和素部分、亲和素部分或抗生物素抗体中的至少一种。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述第二偶联伴侣包括链霉亲和素部分，并且...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。