川贝母对照药材DNA克隆液的制备方法技术

本发明专利技术涉及中药现代化研究领域，是一种使用分子克隆及基因测序技术制备川贝母对照药材DNA克隆液的方法。该方法包括：川贝母对照药材基因组DNA的提取，目的基因PCR扩增和回收；目的基因与PGM‑T载体连接组成重组DNA分子；重组DNA分子转化到DH5α感受态细胞中；“蓝‑白斑”筛选出阳性菌落；提取重组质粒DNA，PCR扩增验证目的基因的正确性；目的基因序列测定与川贝母靶基因进行比对等步骤。本发明专利技术能够准确无误的制备出川贝母对照药材DNA克隆液。直接反映贝母独一无二的DNA序列，检测结果具有高度的稳定性、可靠性。并且使得川贝母对照品取之不尽用之不竭，节约更多的正品川贝母用于临床治病救人。

【技术实现步骤摘要】
川贝母对照药材DNA克隆液的制备方法
本专利技术涉及使用分子克隆及基因测序技术制备川贝母对照药材DNA克隆液。属于中药现代化研究领域。
技术介绍
中药材川贝母是百合科植物，是川贝母(FritillariacirrhosaD.Don)、暗紫贝母(FritillariaunibracteataHsiaoetK.C.Hsia)、甘肃贝母(FritillariaprzewalskiiMaxim)、梭砂贝母(FritillariadelavayiFranch)、太白贝母(FritillariataipaiensisP.Y.Li)或瓦布贝母(FritillariaunibractcataHsiaoetK.C.HsiavarwabuensisS.Y.TangetS.C.YueZ.D.Liu,S.WangerS.C.Chen)的干燥鳞茎，川贝母性微寒而味甘苦，入心肺经，有润肺、止咳、化痰等功效，是我国名贵的中药材。川贝母野生资源往往生长在人烟稀少，气候恶劣的高寒地区，主要分布于四川、云南、西藏、甘肃、青海、宁夏、陕西、山西、河南等省，海拔3000-4000米的山坡草丛或阴湿的小灌木丛，采挖不易且生长周期在4年以上。目前川贝母已经被列入了国家三级保护植物名单，属于珍稀濒危药材。而且由于川贝母良好的止咳化痰功效，中医处方用量相当大，以川贝母为原料生产的中成药达200种以上，商品远不能满足国内外市场的需求，价格越发昂贵，因此，市场上川贝母掺杂、掺假现象及其严重。川贝母药材分布广泛，基源较为复杂，鉴定更加困难。2010年版《中国药典》增补本采用DNA指纹鉴定法作为川贝母检测的国家标准，运用了聚合酶链式反应(PCR)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)以及琼脂糖凝胶电泳等分子生物学技术，将正品川贝母与伪品区分开。按照《中国药典》分子生物学鉴定技术要求，每次实验必须设置川贝母正品(即标准品)为对照药材。正品川贝母药源珍贵，若每次实验都需要重新提取DNA，每次的对照药材都从食品药品监督部门购买，长期会造成巨大的经济负担，并且十分浪费正品川贝母。若自己购买川贝母作为对照药材，又不能保证每次所使用的川贝母都是正品，因而每次使用时需要重新鉴定样品的真伪，浪费时间和精力。并且道地的川贝母的产量稀少，而市场的需求又日益增大，若将大量的道地川贝母用来做对照药材，必定会导致中药材川贝母市场掺杂、掺假现象越来越严重，严重影响着临床用药的安全及疗效，影响着消费者的的利益和生命安全。目前，中药材的对照药材，多以整体中药材、粗制大颗粒或粉末的形式存在，常常因保存不当易发生霉变和虫蛀等现象，会有外源性DNA的存在，直接导致检测结果的不稳定，影响检测结果的直观判断。本专利将经过中国食品药品检验研究院鉴定道地川贝母，通过分子克隆及基因测序技术制备成对照药材DNA克隆液，代替川贝母对照药材，重组菌株可以无限增殖，DNA克隆液取之不尽用之不竭，可以说，一次克隆终身受益。大大节省道地川贝母的用于临床，用于治病救人，有效遏制川贝母市场掺杂、掺假现象，打击假冒伪劣。保障临床用药的安全及疗效，保障消费者的的利益和生命安全。本专利把标准品以DNA的形式储存，直接反映了中药材川贝母独一无二的DNA序列，检测结果具有高度的稳定性、可靠性，并且重现性好、灵敏度高、样品用量少。极大的方便了标准品的储存，确保其稳定性，为检测结果的准确、可靠提供保障。本专利运用分子克隆及基因测序技术，准确无误地实现了川贝母对照药材DNA克隆液的制备，建立与国际主流医药市场接轨的技术标准和统一的鉴定平台，打破技术性贸易壁垒，推动我国中药材标准的现代化、国际化，解决了中药材走向世界的颈瓶，促进我国国药走进国际化市场进程。
技术实现思路
本专利技术取川贝母对照药材(中国食品药品检验研究院121000-201007)，按照《中国药典》2015年版一部第36-37页PCR-RFLP步骤操作，提取川贝母基因组DNA，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分离；在紫外灯下切取PCR扩增产物进行回收，获得川贝母目的基因；利用将目的基因与载体pGM-T进行连接，组成重组DNA分子；将重组DNA分子转化到DH5α感受态细胞中；通过“蓝-白斑”筛选出阳性重组体；从阳性重组菌中提取重组质粒DNA，以重组质粒DNA为模板，使用川贝母引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行验证目的基因的正确性；将重组质粒DNA送至上海生工，采用双向引物对目的基因进行序列测定；将测序结果与川贝母基因组进行比对，比对结果同源性100％，表明克隆川贝母对照药材DNA序列准确无误，因此，川贝母对照药材DNA克隆液可以代替川贝母对照药材作为阳性对照品；将含有序列比对同源性100％的重组质粒DNA的阳性重组菌接种到磁珠中，-80℃长期保存，随时使用，随时复苏；省时省力更节省道地川贝母，检测结果稳定可靠。本专利技术的目的是在于运用分子克隆及基因测序技术，建立一种川贝母对照药材DNA克隆液的制备方法，为中药材检定标准品的制备提供新方法和新思路，促进我国中药材标准现代化、国际化进程。本专利技术的目的是由以下技术方案来实现的：一种川贝母对照药材DNA克隆液的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：(1)分离目的基因即获取川贝母DNA分子取川贝母对照药材(中国食品药品检验研究院121000-201007)，按照《中国药典》2015年版一部第36-37页PCR-RFLP步骤操作，提取川贝母基因组DNA，并进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳进行分离，在紫外灯下切取PCR扩增产物，利用DNA回收试剂盒进行回收，获得川贝母目的基因，并测定其浓度；(2)连接目的基因与载体，组成重组DNA分子利用pGM-T连接试剂盒在冰盒上按照如下顺序加样：ddH2O3μl，10×T4DNALigationBuffer1μl，目的基因(50ng/μl)4μl，pGM-T载体(50ng/μl)1μl，T4DNALigase(3U/μl)1μl，总体积10μl。16℃水浴16-18h；(3)重组DNA分子转化到DH5α感受态细胞中取上述重组DNA分子5μl，加入到含感受态细胞50μl的EP管中，靠冲力混匀，然后冰浴30min，紧接着42℃水浴90s，接着冰浴2min。然后在EP管中加入37℃预热的SOC培养基900μl，轻柔混匀，在37℃培养箱中培养2.5h，然后6000rpm/min，离心3min，弃上清500μl，留菌液400μl，轻轻混匀，涂到2个含有Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上(注意避光)，在37℃培养箱中平板正放40min后倒置放置16-18h，试验设置不含Amp的阴性对照；(4)筛选阳性重组菌菌落在含有“蓝-白斑”的平板上挑取含有重组DNA分子的阳性菌落(即白色菌落)，放入含有Amp的LB液体培养基中，37℃空气浴摇床，220rpm/min，培养16-18h；(5)从阳性重组菌中提取重组质粒DNA进行PCR扩增按照质粒DNA提取试剂盒操作，从阳性重组菌中提取重组质粒DNA，以重组质粒D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种川贝母对照药材DNA克隆液的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：/n(1)分离目的基因即获取川贝母DNA分子/n取川贝母对照药材(中国食品药品检验研究院121000-201007)，按照《中国药典》2015年版一部第36-37页PCR-RFLP步骤操作，提取川贝母基因组DNA，并进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳进行分离。在紫外灯下切取PCR扩增产物，利用DNA回收试剂盒进行回收，获得川贝母目的基因，并测定其浓度；/n(2)连接目的基因与载体，组成重组DNA分子/n利用pGM-T连接试剂盒在冰盒上按照如下顺序加样：ddH2O 3μl，10×T

【技术特征摘要】
1.一种川贝母对照药材DNA克隆液的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离目的基因即获取川贝母DNA分子
取川贝母对照药材(中国食品药品检验研究院121000-201007)，按照《中国药典》2015年版一部第36-37页PCR-RFLP步骤操作，提取川贝母基因组DNA，并进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳进行分离。在紫外灯下切取PCR扩增产物，利用DNA回收试剂盒进行回收，获得川贝母目的基因，并测定其浓度；
(2)连接目的基因与载体，组成重组DNA分子
利用pGM-T连接试剂盒在冰盒上按照如下顺序加样：ddH2O3μl，10×T4DNALigationBuffer1μl，目的基因(50ng/μl)4μl，pGM-T载体(50ng/μl)1μl，T4DNALigase(3U/μl)1μl，总体积10μl，16℃水浴16-18h；
(3)重组DNA分子转化到DH5α感受态细胞中
取上述重组DNA分子5μl，加入到含感受态细胞50μl的EP管中，靠冲力混匀，然后冰浴30min，紧接着42℃水浴90s，接着冰浴2min。然后在EP管中加入37℃预热的SOC培养基900μl，轻柔混匀，在37℃培养箱中培养2.5h，然后6000rpm/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳双，李明成，孙丽媛，艾金霞，赵云东，周亭亭，苑广信，李盈诺，
申请(专利权)人：北华大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22