分子条码化制造技术

提供了用于制备和使用带独特标签的靶核酸分子的方法和组合物。

Molecular barcoding

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分子条码化相关申请本申请要求2017年5月23日提交的美国临时申请62/510,095的权益，该申请通过引用整体并入本文。关于通过EFS-WEB以ASCII文本文件形式提交的“序列表”根据37C.F.R.§§1.821-1.825，在机型IBM-PC，MS-Windows操作系统上，创建于2018年3月8日的2,423字节的文件SEQ_094868-1081968-113210PC_ST25.txt的序列表通过引用全文纳入本文用于所有目的。
技术介绍
下一代测序技术可以从相对较小的样品(例如来自单细胞的核酸(例如，mRNA)样品)提供大量的序列信息。然而，可能难以提取关于样品中核酸的绝对或相对丰度的定量信息。在一些情况下，将独特的分子标识符(UMI)(例如独特的寡核苷酸条码(barcode)序列)连接到靶核酸，并在测序过程中检测此类UMI，可以估计样品中靶核酸的绝对或相对丰度。专利技术概述在一个方面，本专利技术提供了一种用于产生包含带独特标签的靶核酸分子的反应混合物的方法，该方法包括：(a)将多个可变长度条码标签共价连接至多个靶核酸分子的第一端(所述可变长度条码标签由一个或多个核酸序列的0-10个核苷酸组成)，从而所述多个中的个体靶核酸分子包含单个可变长度条码标签，并且所述多个包含至少5个不同的可变长度条码标签长度和/或序列；和(b)使靶核酸分子与多种转座酶接触，从而在所述多个中的个体靶核酸分子的第二端引入转座酶片段化位点和共价连接的转座子端，由此产生多个带独特标签的靶核酸分子，其中所述多个中的个体带独特标签的靶核酸分子包含：(i)位于第一端的可变长度条码标签；和(ii)位于第二端的转座酶片段化位点和转座子端，其中，所述多个中的带独特标签的个体靶核酸分子中的(i)与(ii)的组合一起包含独特分子条码，其相对于反应混合物中的所述多个中的、具有所述可变长度条码标签和所述转座酶片段化位点之间至少25个连续核苷酸的相同序列的所有其它带独特标签的个体靶核酸分子而言是独特的。在一些实施方式中，反应混合物包含具有不同序列的至少1,000个靶核酸分子。在一些实施方式中，共价连接多个可变长度条码标签包括将包含可变长度条码标签的多个引物与包含至少部分靶核酸分子序列的多个核酸分子杂交，并用聚合酶延伸所述引物，由此产生多个双链可变长度条码标签化的靶核酸分子。在一些实施方式中，共价连接多个可变长度条码标签包括将可变长度条码标签连接至所述多个中的靶核酸分子。在一些实施方式中，所述多个核酸分子包含mRNA，并且所述聚合酶是RNA依赖性DNA聚合酶。在另一个实施方式中，所述多个核酸分子包含mRNA，并且包含可变长度条码标签的所述多个引物包含3'寡-dT端。在一些实施方式中，靶核酸分子的第一端包含多聚A区域。在另一个实施方式中，带独特标签的靶核酸分子的第一端包含多聚A区域和/或多聚T区域。在一些实施方式中，可变长度条码标签是多聚A区域的3'和/或多聚T区域的5'。在一些实施方式中，该方法包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前，形成带可变长度条码标签的双链靶核酸分子，其包含与反向互补第二DNA链杂交的第一DNA链。在另一个实施方式中，带可变长度条码标签的双链靶核酸分子包含双链靶cDNA分子。在一些实施方式中，带可变长度条码标签的双链靶核酸分子包含带可变长度条码标签的靶基因组DNA分子。在一些实施方式中，该方法包括，通过以下方式产生带可变长度条码标签的靶基因组DNA分子：使包含可变长度条码标签和基因组DNA靶向区域的多个第一引物与包含至少部分靶核酸分子序列的多个基因组DNA分子杂交，和，用DNA依赖性DNA聚合酶延伸所述引物，由此产生所述带可变长度条码标签的靶基因组DNA分子。在一些实施方式中，该方法包括扩增带可变长度条码标签的靶基因组DNA分子。在一个方面，本专利技术提供了一种形成双链靶cDNA分子的方法，该方法通过如下方式进行：(i)使多个个体引物与多个mRNA分子杂交，其中所述个体引物包含可变长度条码标签，和，用RNA依赖性DNA聚合酶延伸所述引物，由此产生多个双链mRNA:cDNA杂合体，其包含与mRNA分子杂交的第一链cDNA分子；(ii)使所述mRNA:cDNA杂合体与含RNA酶H活性的酶接触，由此产生与第一链cDNA分子杂交的mRNA片段；和(iii)使所述mRNA片段与DNA依赖性DNA聚合酶接触，由此在模板导向的聚合酶反应中延伸所述mRNA片段，其中所述模板是第一链cDNA多核苷酸，和形成双链靶cDNA分子。在一些实施方式中，该方法包括使双链靶cDNA分子与连接酶接触。在一些实施方式中，RNA依赖性DNA聚合酶包含RNA酶H活性。在一些实施方式中，该方法包括使所述mRNA:cDNA杂合体与具有RNA酶H活性的酶接触，并在RNA依赖性DNA聚合酶存在下孵育所述mRNA:cDNA杂合体，由此产生与第一链cDNA分子杂交的mRNA片段。在一些实施方式中，使mRNA:cDNA杂合体与包含RNA酶H活性的酶接触包括使所述mRNA:cDNA杂合体与结构上不同于RNA依赖性DNA聚合酶的酶接触。在一些实施方式中，包括步骤(i)和(ii)的、产生包含带独特标签的核酸分子的反应混合物的方法一起包含用于个体靶核酸分子序列的独特分子标识符，并且多个带独特标签的个体靶核酸分子不包含任何其它独特分子标识符。在一些实施方式中，多个带独特标签的个体靶核酸分子包含细胞条码。在一些实施方式中，多个带独特标签的个体靶核酸分子是cDNA，并且细胞条码是多聚A区域的3'和/或多聚T区域的5'。在一些实施方式中，步骤(a)在反应混合物中进行，其中靶核酸分子来自单细胞。在一些实施方式中，步骤(a)和(b)在反应混合物中进行，其中靶核酸分子来自单细胞。在一些实施方式中，步骤(b)在反应混合物中进行，其中靶核酸分子来自至少10个细胞。在另一个实施方式中，步骤(b)在反应混合物中进行，其中靶核酸分子来自约50至约500个细胞。在一个实施方式中，步骤(b)在反应混合物中进行，其中靶核酸分子来自约10至约5000个细胞。在另一个实施方式中，步骤(b)在反应混合物中进行，其中靶核酸分子来自约10至约10000个细胞。在一些实施方式中，可变长度条码标签由单个核酸序列的0-10个核苷酸组成，其中可变长度条码标签的至少部分包含至少1个核苷酸。在另一个实施方式中，可变长度条码标签由0-5个核苷酸组成，其中可变长度条码标签的至少部分包含至少1个核苷酸。在一些实施方式中，进行方法步骤(a)，然后对在方法步骤(a)中产生的多个双链带可变长度条码标签的靶核酸分子进行步骤(b)，包括或不包括中间扩增步骤。在一些实施方式中，转座子端包含：从5’至3’，GTCTCGTGGGCTCGG(SEQIDNO:2)或从5’至3’，TCGTCGGCAGCGTC(SEQIDNO:3)。在一些实施方式中，转座子端包含，从5’至3’，AGATGTGTATAAGAGACAG(SEQIDNO:4)。在一些实施方式中，转座子端包含，从本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生包含带独特标签的靶核酸分子的反应混合物的方法，所述方法包括：/na)将由一个或多个核酸序列的0-10个核苷酸组成的多个可变长度条码标签共价连接至多个靶核酸分子的第一端，从而所述多个中的个体靶核酸分子包含单个可变长度条码标签，并且所述多个包含至少5个不同的可变长度条码标签长度和/或序列；和/nb)使靶核酸分子与多种转座酶接触，从而转座酶片段化位点和共价连接的转座子端被引入所述多个中的个体靶核酸分子的第二端，由此产生多个带独特标签的靶核酸分子，其中所述多个中的个体带独特标签的靶核酸分子包含：/ni)位于第一端的可变长度条码标签；和/nii)位于第二端的转座酶片段化位点和转座子端，/n其中，所述多个中的带独特标签的个体靶核酸分子中的i)和ii)的组合一起包含独特分子条码，在所述反应混合物中，所述独特分子条码相对于所述多个中的具有可变长度条码标签和转座酶片段化位点之间的至少25个连续核苷酸的相同序列的所有其它带独特标签的个体靶核酸分子而言是独特的。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170523 US 62/510,0951.一种产生包含带独特标签的靶核酸分子的反应混合物的方法，所述方法包括：
a)将由一个或多个核酸序列的0-10个核苷酸组成的多个可变长度条码标签共价连接至多个靶核酸分子的第一端，从而所述多个中的个体靶核酸分子包含单个可变长度条码标签，并且所述多个包含至少5个不同的可变长度条码标签长度和/或序列；和
b)使靶核酸分子与多种转座酶接触，从而转座酶片段化位点和共价连接的转座子端被引入所述多个中的个体靶核酸分子的第二端，由此产生多个带独特标签的靶核酸分子，其中所述多个中的个体带独特标签的靶核酸分子包含：
i)位于第一端的可变长度条码标签；和
ii)位于第二端的转座酶片段化位点和转座子端，
其中，所述多个中的带独特标签的个体靶核酸分子中的i)和ii)的组合一起包含独特分子条码，在所述反应混合物中，所述独特分子条码相对于所述多个中的具有可变长度条码标签和转座酶片段化位点之间的至少25个连续核苷酸的相同序列的所有其它带独特标签的个体靶核酸分子而言是独特的。


2.如权利要求1所述的方法，其中，共价连接多个可变长度条码标签包括将包含可变长度条码标签的多个引物与包含至少部分靶核酸分子序列的多个核酸分子杂交，并用聚合酶延伸所述引物，由此产生多个双链带可变长度条码标签的靶核酸分子。


3.如权利要求2所述的方法，其中，多个核酸分子包括mRNA，聚合酶是RNA依赖性DNA聚合酶，且包含可变长度条码标签的多个引物包含3’寡聚-dT端。


4.如权利要求2所述的方法，其中，所述带独特标签的靶核酸分子的第一端包含多聚A区域和/或多聚T区域，并且其中，所述可变长度条码标签是多聚A区域的3’和/或多聚T区域的5’。


5.如权利要求1所述的方法，其中，共价连接多个可变长度条码标签包括将可变长度条码标签连接至所述多个中的靶核酸分子。


6.如权利要求1所述的方法，其中，在a)之后和b)之前，所述方法包括形成带可变长度条码标签的双链靶核酸分子，其包含与反向互补的第二DNA链杂交的第一DNA链。


7.如权利要求6所述的方法，其中所述带可变长度条码标签的双链靶核酸分子包含双链靶cDNA分子或带可变长度条码标签的靶基因组DNA分子。


8.如权利要求7所述的方法，其中，所述方法包括通过以下方式形成双链靶cDNA分子：
i)使多个个体引物与多个mRNA分子杂交，其中所述个体引物包含可变长度条码标签，并用RNA依赖性DNA聚合酶延伸所述引物，由此产生多个双链mRNA:cDNA杂合体，所述杂合体包含与mRNA分子杂交的第一链cDNA分子；
ii)使mRNA:cDNA杂合体与包含RNA酶H活性的酶接触，从而产生与第一链cDNA分子杂交的mRNA片段；和
iii)使mRNA片段与DNA依赖性DNA聚合酶接触，从而在模板引导的聚合酶反应中延伸mRNA片段，其中模板是第一链cDNA多核苷酸，由此形成双链cDNA分子。


9.如权利要求7所述的方法，其中，所述方法包括，通过以下方式产生带可变长度条码标签的靶基因组DNA分子：使包含可变长度条码标签和基因组DNA靶向区域的多个第一引物与包含至少部分靶核酸分子序列的多个基因组DNA分子杂交，和，用DNA依赖性DNA聚合酶延伸所述引物，由此产生所述带可变长度条码标签的靶基因组DNA分子。


10.如权利要求1所述的方法，其中，所述反应混合物包含1-10,000个不同序列的靶核酸分子。


11.如权利要求1所述的方法，其中，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·雷伯弗斯基，J·阿格雷丝迪，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US