具有热稳定性增加的突变型逆转录酶以及涉及其的产物、方法和用途技术

本发明专利技术涉及相对于野生型具有增加的热稳定性的突变型逆转录酶（RT），编码突变型RT的核酸，包含突变型RT或核酸的细胞，包含突变型RT的试剂盒，突变型RT用于cDNA合成的用途，使用突变型RT用于逆转录包含合成cDNA的RNA的方法，以及使用突变型RT检测样品中的RNA标记物的方法。

Mutant reverse transcriptase with increased thermal stability and related products, methods and uses

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有热稳定性增加的突变型逆转录酶以及涉及其的产物、方法和用途本专利技术涉及相对于野生型具有增加的热稳定性的突变型逆转录酶（RT），编码突变型RT的核酸，包含所述突变型RT或所述核酸的细胞，包含所述突变型RT的试剂盒，突变型RT用于cDNA合成的用途，使用突变型RT用于逆转录包含合成cDNA的RNA的方法，以及使用突变型RT检测样品中的RNA标记物的方法。逆转录酶（RT）[EC2.7.7.49]是负责病毒基因组复制的酶。它具有RNA和DNA依赖性DNA聚合酶以及RNA酶H活性。来自莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）和禽成髓细胞瘤病毒（AMV）的RT广泛用于cDNA合成中，因为它们具有高催化活性和保真度。对于cDNA合成，较高的反应温度是期望的，因为它减少RNA二级结构和非特异性引物结合。因此，改善RT的热稳定性是重要目的。MMLVRT的热稳定性（Kotewicz等人，1985；Gerard等人，2002；Mizuno等人，2010）已通过消除RNA酶H活性得到改善。近年来，MMLVRT的热稳定性通过以下得到进一步改善：在已牵涉与模板-引物的相互作用的位置处引入正电荷（Yasukawa等人，2010）；随机诱变（Arezi和Hogrefe，2009；Baranauskas等人，2012），以及将表面疏水性残基改变成亲水性残基（Konishi等人，2014）。因此，cDNA合成的反应温度已从37−45℃增加到50−55℃。然而，需要进一步的稳定，以改善cDNA合成的效率。对于各种酶，已广泛执行定点诱变和/或随机突变，并且已鉴定了赋予酶期望特性如增强的催化活性或热稳定性的各种突变。如果这些突变的效应是累加的，则具有多重突变的变体酶将具有更期望的特性。然而，一般已知在各种酶的活性和稳定性之间存在妥协：增加酶活性的突变伴随着蛋白质稳定性的降低，并且增加蛋白稳定性的那些突变的确降低了酶活性（Shoichet等人，1995）。另外，目前很难预测突变组合对酶特性的作用。MM3（E286R/E302K/L435R）是热稳定的MMLVRT三重变体，其通过将旨在增加正电荷的三个突变引入野生型MMLVRT内而生成（Yasukawa等人，2010）。然而，本专利技术的目的是提供衍生自MMLV的进一步的热稳定突变型逆转录酶。为此，设计了29个突变。在大肠杆菌（Escherichiacoli）中产生相应的单个变体，并且表征活性和稳定性，并且选择了六个突变（Ala32→Val、Leu41→Asp、Leu72→Arg、Ile212→Arg、Leu272→Glu和Trp388→Arg）。通过将六个突变中的一个或多个与MM3突变结合，设计了15种多重变体。产生并表征了相应的多重变体。六重变体MM3.14（A32V/L72R/E286R/E302K/W388R/L435R）显示出比野生型或突变型MM3更高的热稳定性（参见实施例2以及图4E、4F、5和6）。相应地，在第一个方面，本专利技术涉及相对于SEQIDNO：1的野生型RT具有增加的热稳定性的突变型逆转录酶（RT），所述突变型RT包含：i）相对于SEQIDNO：1的野生型RT具有六个氨基酸取代的氨基酸序列，其中-在位置32处的Ala被Val取代（A32V）；-在位置72处的Leu被Arg取代（L72R）；-在位置286处的Glu被Arg取代（E286R）；-在位置302处的Glu被Lys取代（E302K）；-在位置388处的Trp被Arg取代（W388R）；和-在位置435处的Leu被Arg取代（L435R），或ii）与i）的氨基酸序列至少95%相同，且具有如i）中定义的六个氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述突变型RT显示出逆转录酶活性。逆转录酶（RT）是用于从RNA模板生成互补DNA（cDNA）的酶，该过程称为逆转录。它主要与逆转录病毒相关。然而，非逆转录病毒也使用RT（例如，乙型肝炎病毒，嗜肝DNA病毒科的成员，其为dsDNA-RT病毒，而逆转录病毒是ssRNA病毒）。逆转录病毒RT具有三种序贯的生化活性：RNA依赖性DNA聚合酶活性、核糖核酸酶H和DNA依赖性DNA聚合酶活性。逆转录病毒利用这些活性将单链基因组RNA转换成双链cDNA，其可以整合到宿主基因组内，潜在地生成可能很难根除的长期感染。相同的反应序列广泛用于实验室中，以将RNA转换为DNA，用于分子克隆、RNA测序、聚合酶链反应（PCR）或基因组分析中。在该领域中通常使用的逆转录酶是来自莫洛尼鼠白血病病毒的MMLV逆转录酶。根据本专利技术，突变型RT显示出逆转录酶活性。这意味着突变型RT能够在合适的条件下从RNA模板生成cDNA。用于测定转录酶活性的方法在本文中描述并且在实施例中给出（参照使用[3H]-dTTP的逆转录测定，使用荧光染料PicoGreen的逆转录测定和cDNA合成）。此外，相对于SEQIDNO：1的野生型RT，突变型逆转录酶（RT）具有增加的热稳定性。术语相对于野生型RT“增加的热稳定性（increasedthermostability）”或“增加的热稳定性（increasedthermalstability）”，意指突变型RT在高温（即高于室温或特别是高于40℃）下较不易于丧失（酶）活性。酶的稳定（包括避免变性机制，以便实现其作为催化剂的全部潜能）是生物技术的重要目标。由于酶应用的数目渐增，酶稳定具有重要意义。稳定性中的增加允许持续的可用性（例如，更长的贮存、对于更长时间的可用性等）。此外，对于cDNA合成，较高的反应温度是期望的，因为它减少RNA二级结构和非特异性引物结合。因此，改善RT的热稳定性是期望的。突变型相对于野生型的稳定性增加可以通过比较两种酶（野生型和突变型）例如在贮存或暴露于特定条件（例如高温、干燥、缓冲液或盐）后的剩余活性（绝对剩余活性）来确定。可替代地，如果突变型例如具有较高的相对剩余活性，则与野生型相比，稳定性得到改善。可以通过将在给定条件（例如时间、温度）下温育后的剩余或残余酸度与温育前的初始活性进行比较，来确定相对剩余活性。术语酶活性及其测定是本领域技术人员众所周知的。酶活性一般定义为底物的转换量/时间。酶活性的SI单位为开特（katal）（1开特=1mols−1）。更实际和常用的值是酶单位（U）=1μmolmin−1。1U对应于16.67纳开特，并且定义为每分钟催化1微摩尔底物转换的酶量。酶的比活性是每毫克总蛋白的酶活性（以μmolmin−1mg−1表示）。酶活性可以在测量随着时间过去的底物或辅因子消耗或产物形成的测定中确定。存在测量底物和产物的浓度的许多不同的方法，并且许多酶可以以如本领域技术人员已知的几种不同方式来测定。在本专利技术中，例如使所讨论的RT与RNA模板、引物和合适的dNTP混合物一起温育，并且监测cDNA的产生或dNTP的消耗。监测可以例如通过例如以下来完成：测量在260nm处的UV吸收，标记（例如[3H]-dTTP；参见实施例）的掺入，标记物与DNA的结合（例如PicoGreen®）或PCR（参照实施例）本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种相对于SEQ ID NO：1的野生型逆转录酶（RT）具有增加的热稳定性的突变型RT，所述突变型RT包含/ni）相对于SEQ ID NO：1的野生型RT具有六个氨基酸取代的氨基酸序列，其中/n- 在位置32处的Ala被Val取代（A32V）；/n- 在位置72处的Leu被Arg取代（L72R）；/n- 在位置286处的Glu被Arg取代（E286R）；/n- 在位置302处的Glu被Lys取代（E302K）；/n- 在位置388处的Trp被Arg取代（W388R）；和/n- 在位置435处的Leu被Arg取代（L435R），或/nii）与i）的氨基酸序列至少95%相同，且具有如i）中定义的六个氨基酸取代的氨基酸序列，/n其中所述突变型RT显示出逆转录酶活性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170411 EP 17000621.71.一种相对于SEQIDNO：1的野生型逆转录酶（RT）具有增加的热稳定性的突变型RT，所述突变型RT包含
i）相对于SEQIDNO：1的野生型RT具有六个氨基酸取代的氨基酸序列，其中
-在位置32处的Ala被Val取代（A32V）；
-在位置72处的Leu被Arg取代（L72R）；
-在位置286处的Glu被Arg取代（E286R）；
-在位置302处的Glu被Lys取代（E302K）；
-在位置388处的Trp被Arg取代（W388R）；和
-在位置435处的Leu被Arg取代（L435R），或
ii）与i）的氨基酸序列至少95%相同，且具有如i）中定义的六个氨基酸取代的氨基酸序列，
其中所述突变型RT显示出逆转录酶活性。


2.权利要求1的突变型RT，其中所述突变型RT与SEQIDNO：1的氨基酸序列另外相差在SEQIDNO：1的N末端处的至多五个氨基酸的缺失、和/或在SEQIDNO：1的C末端处的至多五个氨基酸的缺失。


3.权利要求1或2的突变型RT，其中所述突变型RT包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQIDNO：2的氨基酸序列至少96%、97%、98%或99%，特别是100%相同。


4.权利要求1至3中任一项的突变型RT，其中所述突变型RT具有相对于突变型MM3增加的热稳定性，其中MM3具有与SEQIDNO：1的氨基酸序列仅相差三个氨基酸取代的氨基酸序列，其中在位置286处的Glu被Arg取代（E286R），在位置302处的Glu被Lys取代（E302K），并且在位置435处的Leu被Arg取代（L435R）。


5.权利要求1-4中任一项的突变型，其中通过测量在热处理后，特别是在60℃下温育10分钟后测量...

【专利技术属性】
技术研发人员：CH贝尔，H佐贝克，H瓦尔希，K安川，M马场，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH