一种TPBG抗体及其制备方法、其偶联物和应用技术

本发明专利技术公开了一种TPBG抗体及其制备方法、其偶联物和应用。所述TPBG抗体包括TPBG抗体的重链可变区重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3中的一种或多种，和/或，TPBG抗体的轻链可变区轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3中的一种或多种，其氨基酸序列分别如本发明专利技术中所述。所述TPBG抗体是人源化抗体，具有高亲和力，与小分子药物毒素MMAF偶联后制得的偶联物能够对TPBG阳性的细胞有细胞毒杀伤作用，因此运用于治疗肿瘤等药物的制备中。

A tpbg antibody and its preparation, conjugates and Application

【技术实现步骤摘要】
一种TPBG抗体及其制备方法、其偶联物和应用本申请是申请日为2016年12月23日、申请号为201611206936.5、专利技术创造名称为“一种TPBG抗体及其制备方法、其偶联物和应用”的专利申请的分案申请。
本专利技术涉及抗体领域，具体涉及一种TPBG抗体及其制备方法、其偶联物和应用。
技术介绍
在对胚胎干细胞滋养层和癌细胞进行比较时发现一种细胞表面分子，滋养层特异性糖蛋白(TPBG，又称为5T4)，是胚胎滋养层表达的特异性蛋白。人类TPBG蛋白的分子量约为72kDa，包含420个氨基酸，其N端低聚糖结构具有多样性，能够防止蛋白质水解，并且在细胞膜信号传导过程中与其他分子有交互作用。TPBG蛋白共包含7个重复的亮氨酸结构域(LRR)，可参与蛋白质与蛋白质的相互作用。滋养层是胎盘和胎儿之间的一层特殊的胚胎干细胞，TPBG广泛表达于胚胎发育期的各种滋养层细胞。对于正常成人组织中，TPBG只在有限的几种上皮细胞中有表达。但是，TPBG在很多癌细胞中表达，如子宫癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、口腔癌、前列腺癌、肺癌或肾癌组织中都检测到TPBG的表达，在结肠癌、胃癌或卵巢癌中有证据表明TPBG的表达量与癌症的低治愈率相关。而在非小细胞肺癌、肾癌或胰腺癌的组织中，TPBG的表达高达95％以上。很多研究显示，过表达该TPBG能够促进细胞迁移，同时还能够避免免疫监控。在小鼠纤维原细胞中过表达TPBG能够诱导细胞呈现纺锤体形态，降低细胞粘附。在小鼠正常上皮细胞中，同样发现TPBG能够抑制上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)，促进细胞迁移。而TPBG在细胞内的部分有抑制细胞骨架形成的功能。同时，TPBG与上皮细胞间质转移(EMT)相关，TPBG作为胚胎干细胞发育的早期标志物，增加细胞间质蛋白酶的活性，干扰肌动蛋白细胞骨架的排列，下调E-cadherin的表达。还有研究发现，TPBG与CXCR4共定位于细胞膜表明，能够诱导其配体CXCL12趋化因子的结合，促进炎症和肿瘤的扩散。在TPBG阴性细胞中，CXCL12结合另一个受体CXCR7，抑制趋化反应，有利于细胞的生长和存活。Wnt/b-catenin信号通路对发育和细胞再生起到非常重要的作用，TPBG通过抑制LRP6与Wnt受体的内吞，抑制Wnt信号通路，从而抑制细胞粘附和细胞骨架的形成，促进肿瘤的迁移和扩散。还有证据表明TPBG在乳腺癌和胃癌细胞中参与非经典的Wnt通路，同样促进癌细胞的迁移和浸润。抗体药物偶联药物，是由抗体与高效小分子药物通过连接物偶联形成的抗体药物偶联物，能够使高毒性小分子药物特异识别癌细胞上的靶点蛋白，从而特异性杀死癌细胞。近一百年间，基于抗体的免疫疗法与基于化学药物的化学疗法，一直是临床上癌症治疗的两大治疗策略。抗体以肿瘤细胞过度表达的抗原为靶点，多种治疗性单抗已经在临床上取得了巨大成功。在临床实践中，治疗性抗体虽然具有很好的靶向性，但是杀伤作用存在局限性。小分子化学药物虽然具备对癌细胞的高效杀伤作用，但是对非癌细胞也造成同样的伤害。因此临床上抗体药物以及小分子药物各自的局限性，对药物研发提出了新的要求。新一代抗体药物偶联物，利用抗体对靶细胞的特异结合能力，输送高细胞毒的化学药物，实现对癌细胞的靶向高效杀伤。随着新型化学连接技术的出现，抗体药物偶联药在八十年代末开始进入临床研究，目前已经有2个ADC药物经FDA批准上市。ADC药物的开发涉及：药物靶点的筛选、重组抗体的制备、连接物技术开发以及高细胞毒性化合物的筛选优化等几个方面。TPBG作为癌细胞特异表达的蛋白，是ADC药物的候选靶点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服目前缺少TPBG抗体的不足，提供一种亲和力高、特异性强的TPBG抗体及其制备方法和应用，所述的TPBG抗体与人源、小鼠源或食蟹猴源的TPBG蛋白具有高度亲和力。本专利技术还提供一种药物活性成分的偶联物，其包括所述的TPBG抗体和与其偶联的、具有抗肿瘤的功能的小分子化合物，所述的偶联物能够进入细胞，对TPBG阳性的细胞进行细胞毒杀伤作用，能够运用于治疗肿瘤等药物的制备中。本专利技术以人源TPBG蛋白或者过表达人源TPBG蛋白的重组细胞株作为免疫原，采用传统的杂交瘤制备技术(KohlerandMilstein，Nature，1975，256:495)，通过一系列的调整和改进，获得TPBG抗体的先导抗体。再通过对先导抗体的初步生产、纯化和检定，获得具备与人源TPBG蛋白等蛋白具有高度亲和力的TPBG抗体。该TPBG抗体与小分子化合物如MMAF偶联得偶联物，所述偶联物能够进入细胞，对TPBG阳性细胞有优异的细胞毒杀伤作用。然后通过分子生物学方法测序获知所得的TPBG抗体的重链可变区和TPBG抗体的轻链可变区的氨基酸序列。本专利技术提供一种分离的蛋白质，其包括TPBG抗体的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3中的一种或多种，和/或，TPBG抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3中的一种或多种，其中，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2、SEQIDNo.10、SEQIDNo.18、SEQIDNo.26、SEQIDNo.34、SEQIDNo.42、SEQIDNo.50、SEQIDNo.58、SEQIDNo.66或SEQIDNo.74所示；所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.3、SEQIDNo.11、SEQIDNo.19、SEQIDNo.27、SEQIDNo.35、SEQIDNo.43、SEQIDNo.51、SEQIDNo.59、SEQIDNo.67或SEQIDNo.75所示；所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.4、SEQIDNo.12、SEQIDNo.20、SEQIDNo.28、SEQIDNo.36、SEQIDNo.44、SEQIDNo.52、SEQIDNo.60、SEQIDNo.68或SEQIDNo.76所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.6、SEQIDNo.14、SEQIDNo.22、SEQIDNo.30、SEQIDNo.38、SEQIDNo.46、SEQIDNo.54、SEQIDNo.62、SEQIDNo.70或SEQIDNo.78所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.7、SEQIDNo.15、SEQIDNo.23、SEQIDNo.31、SEQIDNo.39、SEQIDNo.47、SEQIDNo.55、SEQIDNo.63、SEQIDNo.71或SEQIDNo.79所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.8、SEQIDNo.16、SEQIDNo.24、SEQIDNo.32、SEQIDNo.40、SEQIDNo.48、SEQIDNo.56、SEQIDNo.64、SEQIDNo.72或SEQIDNo.80所示；或者，所述重链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQIDNo.2、SEQIDNo.10、SEQIDNo.18、SEQIDNo.26、SEQIDNo.34、SEQIDNo.42、SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的蛋白质，其特征在于，其包括TPBG抗体的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，以及TPBG抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；/n所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.50所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.51所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.52所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.54所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.55所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.56所示。/n

【技术特征摘要】
20151224 CN 20151099054561.一种分离的蛋白质，其特征在于，其包括TPBG抗体的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，以及TPBG抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；
所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.50所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.51所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.52所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.54所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.55所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.56所示。


2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.49所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.53所示。


3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区。


4.如权利要求3所述的蛋白质，其特征在于，所述的抗体重链恒定区为人源或小鼠源抗体重链恒定区；所述的抗体轻链恒定区为人源或小鼠源抗体轻链恒定区。


5.如权利要求4所述的蛋白质，其特征在于，所述的抗体重链恒定区为人源抗体重链恒定区；所述的抗体轻链恒定区为人源抗体轻链恒定区。


6.如权利要求1～5中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质是TPBG抗体、单克隆抗体、抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体、单域抗体或单区抗体。


7.一种核酸，其特征在于，其编码如权利要求1～6中任一项所述的蛋白质。


8.如权利要求7所述的核酸，其特征在于，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.93所示；编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.94所示。


9.一种包含如权利要求7或8所述的核酸的重组表达载体。


10.一种包含如权利要求9所述的重组表达载体的重组表达转化体。


11.一种TPBG抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养如权利要求10所述的重组表达转化体，从培养物中获得TPBG抗体。


12.一种免疫偶联物，其特征在于，其包括共价附着至细胞毒剂的、如权利要求1～6中任一项所述的蛋白质。


13.如权利要求12所述的免疫偶联物，其特征在于，1当量如权利要求1～7中任一项所述的蛋白质通过x当量接头与y当量细胞毒剂相连，其具有式1所示结构，
Ab-(L)x...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓岚，张莹，张瑜，胡飞飞，宫世勇，刘礼乐，
申请(专利权)人：凯惠科技发展上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31