一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，利用筛选到的多种应用微生物，将生产春雷霉素和多抗霉素过程产生的菌渣、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物经过酸性蛋白酶酶解、两阶段自然变温发酵、多梯度pH固态混合发酵后，得到的具有生物活性的微生物菌剂，完全去除了菌渣和春雷霉素、多抗霉素残液浓缩物中的异味残留。微生物菌剂中每克活性物料中有效活菌总数超过10亿个，产品粗蛋白占总干物比例达到65‑75%，解决了春雷霉素和多抗霉素生产过程中菌渣和春雷霉素、多抗霉素残液浓缩物的下游处理难度，提高了菌渣作为生产固废的经济价值，生产的混合微生物菌剂在有机肥料和饲料等多个方向的应用前途。

A preparation process of microbial agent based on microbial directed screening

【技术实现步骤摘要】
一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺
本专利技术属于发酵
，具体涉及一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，更具体的涉及一种自然菌株的定向筛选方法，以及以抗生素菌渣为原料的固态混合发酵来制备微生物菌剂的方法。
技术介绍
微生物菌剂是一种低炭、纯天然、无害、无污染的生物原料，属于变废为宝的绿色产业，提高菌渣的附加值，利用科技创新的前沿技术增加生产企业的生产效益，进一步增强医药企业可持续发展。目前国内农产品售价偏低，国内农业原料生产和供应不足，微生物菌剂在有机肥料、饲料等农业方向具有广阔的应用前途。目前国内抗生素菌渣干粉在200万吨/年以上，二次利用效率低，导致资源浪费和二次环境污染。固态混合发酵法在温度、pH以及生物产酶种类和酶量上具有明显优势，多种微生物形成共生群落，生长过程存在协同促进作用，同时在两阶段固态发酵过程，温度和pH的变化在不同阶段，形成不同的优势菌落，能够加快对原料的酶解的作用，形成梯度生长趋势，达到自然发酵的最优状态。另外，多种微生物在在协同作用的同时，产生一定量的抑制素，可以降低有害微生物的入侵和繁殖，有利于工业化扩大培养。利用自然筛选和定向筛选原理，可以得到适应性更强、生产性能良好的微生物菌株。进一步通过培养基的液态和固态发酵，对菌株的生产性能进行测定，可以得到各种酶活相对较高的生产菌株。芽孢杆菌和酵母菌两个菌属的菌株在温度和pH上生长条件范围较宽，且相似，另一方面两个菌属分别可以产生细菌和真菌生长的大量酶类，不同的微生物的优势组合，有利于培养基的高效利用，生长迅速，发酵代谢产物具有醇香类物质，更有利于产品品质的保证。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，其核心步骤包括菌株的定向分离和纯化、菌株的生产组合性能验证、两阶段自然混合发酵工艺。本专利技术涉及两种应用微生物的定向分离和试验筛选过程，其中主要的适应性筛选培养基由春雷霉素菌渣、多抗霉素菌渣、酸性蛋白酶、磷酸氢二钾、玉米皮、硫酸铵、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物、碳酸氢钠等按比例组成。本专利技术利用筛选到的多种应用微生物，将生产春雷霉素和多抗霉素过程产生的菌渣、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物经过酸性蛋白酶酶解、两阶段自然变温、多梯度pH固态混合发酵后，得到的具有生物活性的微生物菌剂，完全去除了菌渣和春雷霉素、多抗霉素残液浓缩物中的异味残留。微生物菌剂中每克活性物料中有效活菌总数超过10亿个，产品粗蛋白占总干物比例达到65-75%。本专利技术解决了春雷霉素和多抗霉素生产过程中菌渣和春雷霉素、多抗霉素残液浓缩物的下游处理难度，提高了菌渣作为生产固废的经济价值，生产的混合微生物菌剂在有机肥料和饲料等多个方向的应用前途，具有很大的经济价值和社会价值。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，从自然界中筛选获得所需应用性微生物，经过纯化和分离，获得纯种菌株。纯种菌株经过液体筛选配方和固态筛选配方应用性筛选后，再进行生产组合筛选，确定组合菌株后，进行固态混合两阶段发酵，获得微生物菌剂。更为具体的，本专利技术所保护的一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，包括以下步骤：1）从生产车间菌渣池和养殖场取含菌样品，使用LB培养基或PDA培养基，进行稀释涂布培养，涂布样品平板在恒温培养箱培养24-36h，挑取不同形态菌落，进行2-3代连续培养纯化，筛选到的纯化平板或斜面菌株通过菌落形态鉴定和镜检初步鉴定后，分别编号标记作为母种库。2）从母种库中分别选取芽孢杆菌和酵母菌平板，挑取单菌落接入LB培养基或PDA培养基中，进行摇瓶培养，摇瓶培养物接种到液体筛选配方中进行适应性筛选培养，恒温培养箱培养12-24h，测定T600和OD280，数据变化明显菌号，按照数据大小次序进行标记，同时镜检进行鉴定确认，确定酵母菌属和芽孢菌属，分别作为一代酵母菌备用菌株库和一代芽孢杆菌备用菌株库。3）对一代备用菌株库内的菌号分别进行液体筛选配方和固态筛选配方连续纯培养，培养时间在24-36h，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH的变化，对符合T600在100以上、OD280在8-10、还原糖先升后降明显并最终降至0.05%以下、pH最低降至5.5-6.5，且培养后期pH有明显回升趋势要求的酵母菌和芽孢杆菌，分别作为二代酵母菌株库和二代芽孢杆菌菌株库。4）对二代菌株库内的菌株，按照一株酵母菌和一株芽孢杆菌的方案进行工艺组合，先使用固态筛选配方进行分别纯培养，培养时间12-24h，然后两种纯培养物混合后，进行固态培养，培养时间48-72h。混合培养阶段，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH数据变化，对符合T600在180-240、OD280在10-15、还原糖降至0.02%以下、pH最低降至5.5-6.5，且培养后期有明显的回升趋势，物料具有明显的醇香的菌株工艺组合方案，进行重复稳定性试验，确定发酵性能稳定的菌株组合，作为生产菌株库。5）配料器中加入生产培养基配方的原料，搅拌均匀后，将物料平均分开，分别加入4）步中生产菌株库中的酵母菌和芽孢杆菌摇瓶纯培养物。6）将搅拌均匀的培养物，分别装入可透气内膜袋中，进行兼性厌氧发酵，发酵24-36h，每12h检测其T600、OD280、还原糖、pH，待发酵物料产生明显醇香味，纯培养发酵结束。7）发酵好的两种纯培养物，在混料器中直接混合，或按比例加入新鲜生产培养基混合，搅拌均匀后装袋，中间每12-24h翻料，根据发酵情况进行20-30%的补料1-2次，兼性厌氧混合发酵48-72h，待物料无异味，且有明显醇香味时，pH在6.0-7.0之间，混合固态发酵结束，得到活性微生物菌剂。进一步的，步骤1）中，从生产车间菌渣池取长时间自然发酵样品，从养殖场取新鲜的鸡粪或猪粪样品。进一步的，步骤1）中，发酵样品进行预处理，LB培养基稀释涂布前，含菌样品进行加热预处理，样品稀释10倍后，煮沸10min处理。PDA培养基稀释涂布前，样品稀释10倍后加入25ug/ml～50ug/ml氨苄青霉素。进一步的，步骤1）中，培养温度控制在36-42℃。进一步的，所述的液体筛选配方原料按重量配比为：春雷霉素菌渣15-25%、多抗霉素菌渣15-25%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、碳酸氢钠0.5%、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物20-30%、纯水30-50%组成。进一步的，所述的固态筛选配方原料按重量配比：春雷霉素菌渣35-45%、多抗霉素菌渣15-25%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、5-10%春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物、玉米皮10-25%、碳酸氢钠0.5-1%、酵母菌或芽孢杆菌摇瓶培养物5-15%，液碱调节pH至7.0-7.5之间，残液浓缩物和玉米皮控制物料理论湿度在40%左右，手握物料后可成型。进一步的，所述的生产培养基配方按重量配比及配料次序：依次加入春雷霉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，其特征在于，从自然界中筛选获得所需应用性微生物，经过纯化和分离，获得纯种菌株，纯种菌株经过液体筛选配方和固态筛选配方应用性筛选后，再进行生产组合筛选，确定组合菌株后，进行固态混合两阶段发酵，获得微生物菌剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，其特征在于，从自然界中筛选获得所需应用性微生物，经过纯化和分离，获得纯种菌株，纯种菌株经过液体筛选配方和固态筛选配方应用性筛选后，再进行生产组合筛选，确定组合菌株后，进行固态混合两阶段发酵，获得微生物菌剂。


2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1）从生产车间菌渣池和养殖场取含菌样品，使用LB培养基或PDA培养基，进行稀释涂布培养，涂布样品平板在恒温培养箱培养24-36h，挑取不同形态菌落，进行2-3代连续培养纯化，筛选到的纯化平板或斜面菌株通过菌落形态鉴定和镜检初步鉴定后，分别编号标记作为母种库；
2）从母种库中分别选取芽孢杆菌和酵母菌平板，挑取单菌落接入LB培养基或PDA培养基中，进行摇瓶培养，摇瓶培养物接种到液体筛选配方中进行适应性筛选培养，恒温培养箱培养12-24h，测定T600和OD280，数据变化明显菌号，按照数据大小次序进行标记，同时镜检进行鉴定确认，确定酵母菌属和芽孢菌属，分别作为一代酵母菌备用菌株库和一代芽孢杆菌备用菌株库；
3）对一代备用菌株库内的菌号分别进行液体筛选配方和固态筛选配方连续纯培养，培养时间在24-36h，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH的变化，对符合T600在100以上、OD280在8-10、还原糖先升后降明显并最终降至0.05%以下、pH最低降至5.5-6.5，且培养后期pH有明显回升趋势要求的酵母菌和芽孢杆菌，分别作为二代酵母菌株库和二代芽孢杆菌菌株库；
4）对二代菌株库内的菌株，按照一株酵母菌和一株芽孢杆菌的方案进行工艺组合，先使用固态筛选配方进行分别纯培养，培养时间12-24h，然后两种纯培养物混合后，进行固态培养，培养时间48-72h；
混合培养阶段，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH数据变化，对符合T600在180-240、OD280在10-15、还原糖降至0.02%以下、pH最低降至5.5-6.5，且培养后期pH有明显回升趋势、物料具有明显的醇香的菌株工艺组合方案，进行重复稳定性试验，确定发酵性能稳定的菌株组合，作为生产菌株库；
5）配料器中加入生产培养基配方的原料，搅拌均匀后，将物料平均分开，分别加入4）步中生产菌株库中的酵母菌和芽孢杆菌摇瓶纯培养物；
6）将搅拌均匀的培养物，分别装入可透气内膜袋中，进行兼性厌氧发酵，发酵24-36h，每12h检测其T600、OD280、还原糖、pH，待发酵物料产生明显醇香味，纯培养发酵结束；
7）发酵好的两种纯培养物，在混料器中直接混合，或按比例加入新鲜生产培养基混合，搅拌均匀后装袋，中间每12-24h翻料，根据发酵情况进行20-30%的补料1-2次，兼性厌氧混合发酵48-72h，待物料无异味，且有明显醇香味时，pH在6.0-7.0之间，混合固态发酵结束，得到活性微生物菌剂。


3.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：马文艳，王卫富，潘忠成，李蒲民，
申请(专利权)人：陕西麦可罗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61