基于运动蛋白的基因转运速度控制装置的制造方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供一种基于运动蛋白的基因转运速度控制装置的制造方法，包括步骤：i)、形成具有多聚阴离子尾的运动蛋白；ii)、提供纳米孔装置，包括壳体、流体腔密封层、柔性基底纳米孔结构、流体腔基座；柔性基底纳米孔结构包括金属层，以缩小纳米孔尺寸至1～100nm；运动蛋白稳定于纳米孔中；运动蛋白通过金属‑硫键锚定于纳米孔中，以使待检测基因链通过纳米孔的转运速度至少慢于0.1ms每碱基对。本发明专利技术使用点击化学方法将运动蛋白锚定在纳米孔中，以使待检测基因链通过纳米孔的转运速度至少慢于0.1ms/每碱基对，再调整温度与pH可以有效地控制基因链的转运速度，可将待检测基因链通过纳米孔51的转运速度进一步降低至数十甚至数百毫秒量级，从而提高光谱检测的灵敏度。

Manufacturing method of gene transport speed control device based on kinesin

【技术实现步骤摘要】
基于运动蛋白的基因转运速度控制装置的制造方法
本专利技术属于基因测序领域和生物分子传感领域，尤其涉及一种基于运动蛋白的基因转运速度控制装置的制造方法。
技术介绍
遗传信息的测量对生命科学和医学领域具有革命性的推动作用。未来精准医疗与个性化医疗需求成本更低、速度更快、精度更高以及读长更长的新型测序技术。新一代单分子实时测序技术解决了读长更长和速度更快的需求；最近飞速发展的生物纳米孔测序技术进一步解决了成本更低的需求。生物纳米孔测序技术不需要准备大量的样品，样品制备过程不需要耗费生物与化学试剂，大大降低了测序成本，也节省了DNA克隆和扩增的时间，节约了时间成本。英国OxfordNanoporeTechnologies(ONT)公司发布第一款商用生物纳米孔测序仪MinION，具有手掌大小的体积，便携性非常好，极大地拓展了测序仪的应用场景。比如MinION被用于非洲地区的埃博拉病毒的快速检测和鉴定工作，被美国国家航空航天局用于太空中的测序工作。然而，目前的生物纳米孔镶嵌在脂双层膜上，对环境敏感(pH，温度，盐浓度等)，稳定性和耐用性比较差，使用寿命有限；另外，生物纳米孔一般只能采用离子阻断电流的检测机制，需要特制低噪电流放大电路达到足够的灵敏度，使测序单元的大规模矩阵化集成具有非常大的挑战性。为克服生物纳米孔的缺点，具有良好稳定性、耐用性，适合大规模批量生产，容易与光电检测集成的固态纳米孔被广泛研究。目前的固态纳米孔技术主要也是通过测量离子阻断电流来实现测序，但其面临诸多挑战：首先，DNA链在纳米孔中的转运行为不易控制，碱基的朝向不受控制，具有很大的随机性，DNA移动速度太快(0.1～1μs/bp)；DNA与纳米孔表面发生非特异性结合，形成二级或三级结构，阻塞纳米孔，限制DNA链的正常转运行为；在传统的生物和固态纳米孔检测技术中，一般使用离子阻断电流来分辨不同的碱基序列，然而电流检测技术具有一个本质的局限性：纳米孔周围的电场会向两侧延伸，导致纳米孔有效长度延长，限制了检测分辨率。这些问题都严重限制了固态纳米孔测序技术的成功实现。为了解决上述问题，本专利技术提出下面几项技术方案，以实现方便快捷准确的纳米孔测序：新型柔性基底固态纳米孔制备技术；模块化的纳米孔装置实时快速组装模式；使用运动蛋白有效地控制DNA或RNA在固态纳米孔中的转运速度；将光谱测量技术结合至固态纳米孔测量中，提高序列测量的准确度。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供基于运动蛋白的DNA转运速度控制装置，用于解决固态纳米孔存在的几个问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种基于运动蛋白的基因转运速度控制装置，包括运动蛋白、壳体、流体腔密封层、柔性基底纳米孔结构、流体腔基座、电源、第一电极和第二电极，所述第一电极和所述第二电极分别与所述电源的两极相连接；所述柔性基底纳米孔结构包括柔性基底、孔基底和纳米孔结构，所述纳米孔结构包括纳米孔腔、纳米孔；所述纳米孔腔贯穿所述孔基底，所述纳米孔是所述纳米孔腔的一端开口，所述纳米孔腔呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔延伸；所述纳米孔结构还包括：光栅，所述光栅围绕所述纳米孔腔，所述光栅形成于所述孔基底上远离所述纳米孔的面上，所述光栅由多组光栅槽构成，孔保护膜，覆盖所述光栅和所述纳米孔腔，金属层，覆盖所述孔保护膜，以缩小所述纳米孔尺寸至1～100nm；流体腔，由所述柔性基底不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔、围绕所述光栅和所述纳米孔腔上方形成，所述柔性基底纳米孔结构包括第一液体流道，所述第一液体流道连接外部与所述流体腔，以向所述流体腔输入或排出溶液；所述流体腔基座包括流体下腔、第二液体流道，所述第二液体流道连接外部与所述流体下腔，以输入或排出所述流体下腔内溶液；所述流体腔密封层密封所述流体腔；所述壳体包括流道开口，分别与所述第一液体流道和第二液体流道对应；所述运动蛋白与所述金属层形成金属-硫键，以使待检测基因链通过所述纳米孔的转运速度至少慢于0.1ms/每碱基对。优选地，所述运动蛋白包括DNA聚合酶、DNA螺旋酶或RNA聚合酶。优选地，所述DNA聚合酶是DNA聚合酶I-V、DNA聚合酶α,β,γ,δ,ε,ζ中的一种；所述DNA螺旋酶是超家族I-III、类DnaB家族、类ρ家族中的一种。优选地，所述金属层是铜、银、金、锌、汞、镉、钴、镍或铝中的一种。优选地，所述流体腔基座是聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚异戊二烯、丙烯酸脂、甲基丙烯酸甲酯、邻叠氮萘醌、线性酚醛树脂、硅酮胶、玻璃胶材料、或SU-8高分子聚合物材料中的一种。优选地，所述流体腔基座是硅或二氧化硅材料。优选地，所述流体腔密封层是石英、玻璃或透明材料密封片。优选地，所述第一电极和所述第二电极是铂、金、银、氮化钛及其衍生配对电极材料中的一种，所述第一电极和所述第二电极表面进行化学修饰，提高电极界面电化学稳定性，所述化学修饰是在所述第一电极和所述第二电极表面形成二茂铁分子层。优选地，所述电源位于所述壳体内部，所述第一电极位于所述柔性基底上方，所述第二电极位于所述流体下腔底部。优选地，所述第一电极镶嵌集成在所述柔性基底上方。还提供一种基于运动蛋白的基因转运速度控制装置的制造方法，步骤如下：i)、形成具有多聚阴离子尾的运动蛋白；ii)、提供纳米孔装置，包括壳体、流体腔密封层、柔性基底纳米孔结构、流体腔基座、电源、第一电极和第二电极，所述第一电极和所述第二电极分别与所述电源的两极相连接；所述柔性基底纳米孔结构包括柔性基底、孔基底和纳米孔结构，所述纳米孔结构包括纳米孔腔、纳米孔；所述纳米孔腔贯穿所述孔基底，所述纳米孔是所述纳米孔腔的一端开口，所述纳米孔腔呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔延伸；所述纳米孔结构还包括：光栅，所述光栅围绕所述纳米孔腔，所述光栅形成于所述孔基底上远离所述纳米孔的面上，所述光栅由多组光栅槽构成；孔保护膜，覆盖所述光栅和所述纳米孔腔；金属层，覆盖所述孔保护膜，以缩小所述纳米孔尺寸至1～100nm；流体腔，由所述柔性基底不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔、围绕所述光栅和所述纳米孔腔上方形成；所述柔性基底纳米孔结构包括第一液体流道，所述第一液体流道连接外部与所述流体腔，以向所述流体腔输入或排出溶液；所述流体腔基座包括流体下腔、第二液体流道，所述第二液体流道连接外部与所述流体下腔，以输入或排出所述流体下腔内溶液；所述流体腔密封层密封所述流体腔；所述壳体包括流道开口，分别与所述第一液体流道和第二液体流道对应；使用电泳方法驱动所述多聚阴离子尾，多聚阴离子尾牵引所述运动蛋白，将所述运动蛋白稳定于所述纳米孔中；切除所述多聚阴离子尾，以露出半胱氨酸的巯基；所述巯基与金属层表面形成金属-硫键，所述运动蛋白通过金属-硫键锚定于纳米孔中，以使待检测基因链通过所述纳米孔的转运速本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于运动蛋白的基因转运速度控制装置的制造方法，步骤包括：/ni)、形成具有多聚阴离子尾的运动蛋白；/nii)、提供纳米孔装置，包括壳体、流体腔密封层、柔性基底纳米孔结构、流体腔基座、电源、第一电极和第二电极，所述第一电极和所述第二电极分别与所述电源的两极相连接；/n所述柔性基底纳米孔结构包括柔性基底、孔基底和纳米孔结构，所述纳米孔结构包括纳米孔腔、纳米孔；所述纳米孔腔贯穿所述孔基底，所述纳米孔是所述纳米孔腔的一端开口，所述纳米孔腔呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔延伸；/n所述纳米孔结构还包括：光栅，所述光栅围绕所述纳米孔腔，所述光栅形成于所述孔基底上远离所述纳米孔的面上，所述光栅由多组光栅槽构成；孔保护膜，覆盖所述光栅和所述纳米孔腔；金属层，覆盖所述孔保护膜，以缩小所述纳米孔尺寸至1～100nm；流体腔，由所述柔性基底不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔、围绕所述光栅和所述纳米孔腔上方形成；/n所述柔性基底纳米孔结构包括第一液体流道，所述第一液体流道连接外部与所述流体腔，以向所述流体腔输入或排出溶液；/n所述流体腔基座包括流体下腔、第二液体流道，所述第二液体流道连接外部与所述流体下腔，以输入或排出所述流体下腔内溶液；/n所述流体腔密封层密封所述流体腔；/n所述壳体包括流道开口，分别与所述第一液体流道和第二液体流道对应；/n使用电泳方法驱动所述多聚阴离子尾，多聚阴离子尾牵引所述运动蛋白，将所述运动蛋白稳定于所述纳米孔中；/n切除所述多聚阴离子尾，以露出半胱氨酸的巯基；所述巯基与金属层表面形成金属-硫键，所述运动蛋白通过金属-硫键锚定于纳米孔中，以使待检测基因链通过所述纳米孔的转运速度至少慢于0.1ms每碱基对。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于运动蛋白的基因转运速度控制装置的制造方法，步骤包括：
i)、形成具有多聚阴离子尾的运动蛋白；
ii)、提供纳米孔装置，包括壳体、流体腔密封层、柔性基底纳米孔结构、流体腔基座、电源、第一电极和第二电极，所述第一电极和所述第二电极分别与所述电源的两极相连接；
所述柔性基底纳米孔结构包括柔性基底、孔基底和纳米孔结构，所述纳米孔结构包括纳米孔腔、纳米孔；所述纳米孔腔贯穿所述孔基底，所述纳米孔是所述纳米孔腔的一端开口，所述纳米孔腔呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔延伸；
所述纳米孔结构还包括：光栅，所述光栅围绕所述纳米孔腔，所述光栅形成于所述孔基底上远离所述纳米孔的面上，所述光栅由多组光栅槽构成；孔保护膜，覆盖所述光栅和所述纳米孔腔；金属层，覆盖所述孔保护膜，以缩小所述纳米孔尺寸至1～100nm；流体腔，由所述柔性基底不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔、围绕所述光栅和所述纳米孔腔上方形成；
所述柔性基底纳米孔结构包括第一液体流道，所述第一液体流道连接外部与所述流体腔，以向所述流体腔输入或排出溶液；
所述流体腔基座包括流体下腔、第二液体流道，所述第二液体流道连接外部与所述流体下腔，以输入或排出所述流体下腔内溶液；
所述流体腔密封层密封所述流体腔；
所述壳体包括流道开口，分别与所述第一液体流道和第二液体流道对应；
使用电泳方法驱动所述多聚阴离子尾，多聚阴离子尾牵引所述运动蛋白，将所述运动蛋白稳定于所述纳米孔中；
切除所述多聚阴离子尾，以露出半胱氨酸的巯基；所述巯基与金属层表面形成金属-硫键，所述运动蛋白通过金属-硫键锚定于纳米孔中，以使待检测基因链通过所述纳米孔的转运速度至少慢于0.1ms每碱基对。


2.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述运动蛋白包括DNA聚合酶、DNA螺...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈昌，胡春瑞，豆传国，
申请(专利权)人：上海新微技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31