【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学诊断领域，涉及血液传播病毒的检测，特别是霍乱弧菌的诊断和检测技术，具体来说是一种特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光pcr检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、霍乱弧菌(vibrio cholerae)是引起人类霍乱的病原体，曾在世界上引起多次大流行，其症状主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，且发病急、传染性强、病死率高，属于国际检疫传染病。
2、霍乱弧菌(vibrio cholerae)是革兰氏阴性菌，共分为139个血清群，其中01和0139这两种霍乱弧菌的血清型能够引起疾病暴发。大多数的疾病暴发由01型霍乱弧菌引起，而1992年首次在孟加拉国确定的0139型仅限于东南亚一带。非01非0139霍乱弧菌可引起轻度腹泻，但不会造成疾病流行。
3、霍乱的致病机制很复杂，霍乱弧菌粘附和定居于小肠粘膜，产生肠毒素，进而破坏小肠上皮细胞对离子转运的过程。霍乱弧菌的致病需要多个毒力因子的参与，其中ctxab基因编码的霍乱毒素(ctx)是霍乱弧菌致腹泻的主要致病因子。
4、霍乱弧菌的检测方法主要包括传统的生化鉴定，血清凝集法以及聚合酶链反应法(即pcr法)。相比于传统的生化鉴定和血清凝集法的操作复杂、检测灵敏度低的劣势，pcr法由于其高灵敏度、高特异、操作简单的优势而被广泛用于病原体的检测。实时荧光pcr法是传统pcr法衍生出来的一种通过荧光信号实时监测pcr过程的检测方法，检测灵敏度更高，特异性更好。然而，常规的实时荧光pcr法检测时间一般较长，需要1个半小时左右，本专利技术开发了一种更快的
技术实现思路
1、针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光pcr检测试剂盒及检测方法，通过设计霍乱弧菌ctx特异性引物和探针，使霍乱弧菌ctx毒力基因pcr检测的时间缩短至7分钟，可解决现有技术中的方法检测时间长、灵敏度不高的技术问题。
2、本专利技术提供了一种特异性霍乱毒素(ctx)毒力基因快速荧光pcr检测试剂盒，包括如下试剂：
3、(1)pcr反应液：包括pcr反应缓冲液，一对霍乱弧菌ctx特异性的正、反引物，一对内标特异性的正、反引物，一条霍乱弧菌ctx特异性的荧光探针，一条内标特异性的荧光探针；霍乱弧菌ctx特异性引物和探针根据霍乱弧菌ctx毒力基因a设计得到，内标特异性引物和探针根据人类基因组rnase p基因序列设计得到；荧光探针由荧光报告基团与荧光淬灭基团双色标记；
4、(2)酶混合液：包括taq酶、ung酶和甘油
5、(3)阳性对照：包括霍乱弧菌ctx毒力基因dna片段和人基因组dna片段
6、(4)阴性对照：包括人基因组dna片段
7、所述(1)中霍乱弧菌多核苷酸扩增的一对正、反引物；内标特异性多核苷酸扩增的一对正、反引物的序列件序列表seq id no.1-4；
8、正向引物1：seq id no.1反向引物1：seq id no.2
9、正向引物2：seq id no.3反向引物2：seq id no.4
10、所述(1)中用于荧光pcr扩增的霍乱弧菌ctx探针和内标特异性探针序列分别见序列表seq id no.5-6。
11、所述pcr反应缓冲液包括300mm tris-hcl溶液、mg2+溶液、终浓度为1200μm的datp、dgtp、dctp，终浓度为300μm的dtip，终浓度为900μm的dutp。
12、进一步的，所述mg2+溶液的终浓度为10mm-25mm。
13、优选地，所述mg2+溶液的终浓度为15mm。
14、所述taq酶的终浓度为0.5u/μl-1.5u/μl，所述甘油的体积百分比为50％。
15、优选地，所述taq酶的终浓度为1u/μl；所述ung酶的终浓度为0.1u/μl。
16、所述pcr反应液中霍乱弧菌ctx特异性引物的终浓度为0.5pmol/μl-3pmol/μl；所述霍乱弧菌ctx探针的终浓度为0.25pmol/μl-1.5pmol/μl。
17、所述pcr反应液中霍乱弧菌ctx特异性引物的终浓度为2pmol/μl，所述霍乱弧菌ctx探针的终浓度1pmol/μl。
18、优选地，pcr反应缓冲液为300mm的ph 8.8的tris-hcl溶液，15mm的mg2+溶液，终浓度分别为1200μm的datp、dgtp、dctp，终浓度为300μm的dtip，终浓度为900μm的dutp，终浓度分别为2pmol/μl的ctx上游引物
19、(ctx-f)、2pmol/μl的ctx下游引物(ctx-r)，1pmol/μl的ctx-fam探针(ctx-p-fam)，终浓度分别为1pmol/μl的内标上游引物(ic-f)、1pmol/μl的内标下游引物(ic-r)，终浓度0.5pmol/μl的内标-rox探针(ic-p-rox)；所述酶混合液包括1u/μl的taq酶，0.1u/μl的ung酶，体积百分比浓度50％的甘油。
20、一种检测霍乱弧菌ctx毒力基因的方法，包括以下步骤：
21、s1：样本dna的提取；
22、s2：根据特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光pcr检测试剂盒进行实时荧光pcr扩增及检测；
23、s3：结果分析。
24、所述s2中，pcr扩增体系包括：1μl pcr反应缓冲液、1μl的酶混合液以及4μldna样本。
25、所述pcr循环条件为：98℃1min，循环(98℃0s、60℃3s，45个循环)；其中60℃3s设定为读荧光，荧光通道选择为ctx-fam，ic-rox。
26、与现有技术相比，本专利技术根据霍乱弧菌ctx毒力基因诊断序列和人基因组序列设计引物、探针，优化了pcr反应条件来提高检测灵敏度，可实时通过荧光信号值观察扩增结果；同时，本专利技术荧光pcr检测试剂盒设计严谨，加入了人基因组管家基因rnase p基因作为内标来监控pcr检测过程操作简单灵敏度高，特异性强，能高效鉴定霍乱弧菌ctx毒力基因的存在。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：
2.根据权利要求1所述的特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应缓冲液包括300mM Tris-HCl溶液、Mg2+ 溶液、终浓度为1200μM的dATP、dGTP、dCTP，终浓度为 300μM的dTTP，终浓度为 900μM 的dUTP。
3.根据权利要求2所述的特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述Mg2+溶液的终浓度范围是10mM-25mM。
4.根据权利要求2所述的特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述Mg2+溶液的终浓度为15mM。
5.根据权利要求1所述的特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述Taq 酶的终浓度范围为 0.5U/μl-1.5U/μl，所述甘油的体积百分比为50%。
6.根据权利要求5所述的特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述Taq酶的终浓度为1U/μl，所述 UNG 酶的
7.根据权利要求1所述的特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述 PCR 反应液中霍乱弧菌CTX特异性引物的终浓度为0.5pmol/ μl-3pmol/μl ；所述霍乱弧菌CTX探针的终浓度为 0.25pmol/μl-1.5pmol/μl。
8.根据权利要求7所述的特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述 PCR 反应液中霍乱弧菌CTX特异性引物的终浓度为 2pmol/μl,所述霍乱弧菌CTX探针的终浓度 1pmol/μl。
9.一种检测霍乱弧菌CTX毒力基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述检测霍乱弧菌CTX毒力基因的方法，其特征在于， 所述PCR扩增的循环条件为：98℃ 1min，循环 (98℃ 0s、60℃ 3s，45个循环)；其中 60℃ 3s 设定为读荧光，荧光通道选择为 Ctx-FAM，IC-ROX。
...【技术特征摘要】
1.一种特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：
2.根据权利要求1所述的特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，所述pcr反应缓冲液包括300mm tris-hcl溶液、mg2+ 溶液、终浓度为1200μm的datp、dgtp、dctp，终浓度为 300μm的dttp，终浓度为 900μm 的dutp。
3.根据权利要求2所述的特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，所述mg2+溶液的终浓度范围是10mm-25mm。
4.根据权利要求2所述的特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，所述mg2+溶液的终浓度为15mm。
5.根据权利要求1所述的特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，所述taq 酶的终浓度范围为 0.5u/μl-1.5u/μl，所述甘油的体积百分比为50%。
6.根据权利要求5所述的特异性霍乱毒素毒力基因快速荧光pcr检测试剂盒，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘博，
申请(专利权)人：上海新微技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。