一种用于培养牛至愈伤组织的诱导培养基及诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种用于牛至愈伤组织的诱导培养基及诱导方法。其中的诱导培养基，以1L计，其包括如下用量的组分：B5基础盐培养基、蔗糖20～30g/L、琼脂6～8g/L、肌醇80～120mg/L、6‑BA 2～3.5mg/L、NAA 0.2～0.6mg/L、黑曲霉提取物80～150mg/L、胆碱1～1.8g/L、其余为水。使用本发明专利技术的诱导培养基可用于培养牛至愈伤组织，愈伤组织诱导率可达70％～90％，愈伤组织状态良好，适合大规模悬浮培养。

A medium and method for callus induction of Origanum vulgare

【技术实现步骤摘要】
一种用于培养牛至愈伤组织的诱导培养基及诱导方法
本专利技术具体涉及一种用于培养牛至愈伤组织的诱导培养基及诱导方法。
技术介绍
牛至(学名：OriganumvulgareL.)是唇形科，牛至属多年生半灌木或草本植物。具有较高的药用价值和经济价值。牛至可入药，可预防流感，治中暑、感冒、头痛身重、腹痛、呕吐、胸膈胀满、气阻食滞、小儿食积腹胀、腹泻、月经过多、崩漏带下、皮肤搔痒及水肿等症，其散寒发表功用，尤胜于薄荷。牛至中富含咖啡酸和迷迭香酸，在抗氧化、抗抑郁、抑菌消炎、抗病毒、抗过敏等方面均有显著作用。目前，现有技术还没有适合于用于培养牛至愈伤组织的诱导培养基，常规的诱导培养基以及方法诱导牛至愈伤组织的诱导率低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了客服现有技术中没有可用于培养牛至愈伤组织的培养基，使用常规的诱导培养基无法培养出牛至愈伤组织或是诱导率极低缺陷，而提供了一种用于培养牛至的培养基及诱导方法。本专利技术的用于培养牛至的培养基可培养出牛至的愈伤组织且得到的愈伤组织的诱导率较高。本专利技术通过以下技术方案解决上述技术问题。本专利技术提供了一种用于培养牛至的诱导培养基，以培养基1L计，包括如下用量的组分：B5基础盐培养基、蔗糖20-30g/L、琼脂6-8g/L、肌醇80-120mg/L、6-BA2～3.5mg/L、NAA0.2～0.6mg/L、胆碱1～1.8g/L、黑曲霉提取物80～150mg/L，其余为水。本专利技术中，所述的B5基础盐培养基可为本领域常规，通常为KNO32500mg/L、MgSO4·7H2O250mg/L、CaCl2·2H2O150mg/L、(NH4)2SO4134mg/L、NaH2PO4·H2O150mg/L、KI0.75mg/L、H3BO33.0mg/L、MnSO4·4H2O10mg/L、ZnSO4·7H2O2.0mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、Na2-EDTA37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵素10mg/L。本专利技术中，较佳地，所述的蔗糖的用量为23～27g/L。本专利技术中，较佳地，所述的琼脂的用量为7～8g/L。本专利技术中，较佳地，所述肌醇的用量为90～110mg/L。本专利技术中，较佳地，所述6-BA的用量为2.5～3mg/L。本专利技术中，较佳地，所述NAA的用量为0.4～0.6mg/L。本专利技术中，较佳地，所述胆碱的用量为1.3～1.6g/L。本专利技术中，较佳地，所述黑曲霉提取物的用量为100～130mg/L。本专利技术中，所述的黑曲霉的提取物的制备方法可为本零领域常规，较佳地包括以下步骤：将黑曲霉菌丝用0.05～0.2mol/L，pH为6～7的磷酸盐缓冲液洗涤，再经匀浆、抽滤、121℃灭菌15～20min后即为黑曲霉提取物。并采用蒽酮-硫酸比色法测定黑曲霉提取物中多糖含量，并以此表示黑曲霉提取物浓度。其中所述磷酸缓冲溶液的浓度较佳地为0.1mol/L，磷酸盐缓冲液的pH较佳地为7。本专利技术中，较佳地，以培养基1L计，其包括如下用量的组分：B5基础盐培养基、蔗糖23～27g/L、琼脂7～8g/L、肌醇90～110mg/L、6-BA2.5～3mg/L、NAA0.4～0.6mg/L、胆碱1.3～1.6g/L、黑曲霉提取物100～130mg/L、其余为水，所述黑曲霉提取物通过以下步骤制得：将黑曲霉菌丝用0.05～0.2mol/L，pH为6～7的磷酸盐缓冲液洗涤，再经匀浆、抽滤、121℃灭菌15～20min后即为黑曲霉提取物。本专利技术中，较佳地，以培养基1L计，其由如下用量的组分组成：B5基础盐培养基、蔗糖23～27g/L、琼脂7～8g/L、肌醇90～110mg/L、6-BA2.5～3mg/L、NAA0.4～0.6mg/L、胆碱1.3～1.6g/L、黑曲霉提取物100～130mg/L、其余为水，所述黑曲霉提取物通过以下步骤制得：将黑曲霉菌丝用0.05～0.2mol/L，pH为6～7的磷酸盐缓冲液洗涤，再经匀浆、抽滤、121℃灭菌15～20min后即为黑曲霉提取物。本专利技术中，较佳地，以培养基1L计，其由如下用量的组分组成：B5基础盐培养基、蔗糖25g/L、琼脂7g/L、肌醇100mg/L、6-BA3mg/L、NAA0.4mg/L、胆碱1.5g/L、黑曲霉提取物100mg/L，其余为水，所述黑曲霉提取物通过以下步骤制得：将黑曲霉菌丝用0.1mol/L，pH为7的磷酸盐缓冲液洗涤，再经匀浆、抽滤、121℃灭菌15～20min后即为黑曲霉提取物。本专利技术还提供了一种上述诱导培养基用于牛至愈伤组织的诱导方法，其采用上述的培养基进行诱导。本专利技术中，所述的诱导方法较佳地包括以下步骤:步骤(1)制备牛至无菌苗；步骤(2)牛至愈伤组织诱导：将步骤(1)中的牛至无菌苗修剪出叶、茎、根，将叶、茎、根分别接入所述的诱导培养基中，得牛至胚性愈伤组织；步骤(3)从步骤(2)中的牛至胚性愈伤组织传代培养4代后，得状态均一稳定的牛至胚性愈伤组织，然后接入牛至液体培养基中进行悬浮培养。步骤(1)中，所述的牛至无菌苗的制备可为本领域常规，所述的牛至无菌苗的制备较佳地包括以下步骤：挑选颗粒饱满的牛至种子，100mg/L赤霉素浸泡12h，并将种子消毒后，接种入牛至生长培养基，25℃光照培养20天，得到牛至无菌苗。所述牛至生长培养基的组分组成：B5基础盐培养基、蔗糖25g/L、琼脂7g/L、肌醇100mg/L和水。步骤(2)中，所述的牛至无菌苗修剪可为本领域常规，较佳地，修剪出的叶为0.2cm2。步骤(2)中，所述的牛至无菌苗修剪可为本领域常规，较佳地，修剪出的茎为1cm。步骤(2)中，所述的牛至无菌苗修剪可为本领域常规，较佳地，修剪出的根为1cm。步骤(3)中，所述的均一稳定的牛至胚性愈伤组织获得可为本领域常规，较佳地，挑选质地松散，黄白色新鲜牛至胚性愈伤组织传代，重复4次，获得均一稳定的牛至胚性愈伤组织。步骤(3)中，所述的牛至愈伤组织接种入摇瓶的操作可为本领域常规，较佳地，将7.5％的鲜重牛至胚性愈伤组织接入到装液量为100ml的250ml摇瓶中，110rpm转速的摇床暗培养25天。步骤(3)中，所述的牛至液体培养基较佳地为上述诱导培养基中除琼脂以外的组分组成。在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：采用植物细胞悬浮培养技术培养牛至细胞，可用牛至活性物质咖啡酸和迷迭香酸的提取。培养过程不受自然环境对植物细胞生长的影响，不受环境中不稳定因素对产品质量的影响。可获得牛至细胞干重16.7g/L，咖啡酸287.24mg/L，迷迭香酸357.38mg/L。附图说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于培养牛至愈伤组织的诱导培养基，其特征在于，以培养基1L计，其包括如下用量的组分：B5基础盐培养基、蔗糖20-30g/L、琼脂6-8g/L、肌醇80-120mg/L、6-BA 2～3.5mg/L、NAA 0.2～0.6mg/L、胆碱1～1.8g/L、黑曲霉提取物80～150mg/L，其余为水。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于培养牛至愈伤组织的诱导培养基，其特征在于，以培养基1L计，其包括如下用量的组分：B5基础盐培养基、蔗糖20-30g/L、琼脂6-8g/L、肌醇80-120mg/L、6-BA2～3.5mg/L、NAA0.2～0.6mg/L、胆碱1～1.8g/L、黑曲霉提取物80～150mg/L，其余为水。


2.如权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述的B5基础盐培养基为KNO32500mg/L、MgSO4·7H2O250mg/L、CaCl2·2H2O150mg/L、(NH4)2SO4134mg/L、NaH2PO4·H2O150mg/L、KI0.75mg/L、H3BO33.0mg/L、MnSO4·4H2O10mg/L、ZnSO4·7H2O2.0mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、Na2-EDTA37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵素10mg/L。


3.如权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述蔗糖的用量为23～27g/L；
和/或，所述琼脂的用量为7-8g/L；
和/或，所述肌醇的用量为90-110mg/L；
和/或，所述6-BA的用量为2.5～3mg/L；
和/或，所述NAA的用量为0.4～0.6mg/L；
和/或，所述胆碱的用量为1.3～1.6g/L；
和/或，所述黑曲霉提取物的用量为100～130mg/L。


4.如权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述黑曲霉提取物通过以下步骤制得：将黑曲霉菌丝用0.05～0.2mol/L，pH为6～7的磷酸盐缓冲液洗涤，再经匀浆、抽滤、121℃灭...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭美锦，尹学健，祝晓丰，张幸子，王泽建，肖慈英，储炬，庄英萍，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31