一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法，包括：(1)外植体的选择；(2)芽的形成；(3)芽的增殖；(4)在芽伸长培养基上促进芽伸长；(5)茎尖培养诱导新芽；(6)增殖；所述茎尖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA或MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.5～0.7mg/L TDZ；(7)筛选出无溃疡病病原菌的新芽无性系并扩繁；(8)组培苗的获得；(9)溃疡病病原菌检测与栽培。使用无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗可以杜绝通过种苗传播溃疡病、将溃疡病病原菌带入果园，大大降低果园溃疡病的发生风险和防治成本。

A production method of kiwifruit seedling without pathogen of canker

【技术实现步骤摘要】
一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法
本专利技术涉及苗木繁殖
，尤其涉及一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法。
技术介绍
猕猴桃含有丰富的有机和无机营养，是世界上重要水果之一。由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，PSA)引起的溃疡病是猕猴桃的毁灭性病害，严重威胁猕猴桃的种植业。该病传播易、发病快、致病性强、防治难度大，发病轻时导致减产、品质下降，严重时造成大量树体死亡，甚至毁灭整个果园，已被列为我国森林植物检疫性病害。现在人工栽培的猕猴桃都可以感染溃疡病，不少重要品种，如“红阳”、“大红”、“华朴3号”、“早鲜”、“早艳”、“黄肉优系11-7”、“黄肉优系Y-HZ201201”等，对溃疡病抗性差，更易发生溃疡病。由于生产上通常是通过嫁接方法生产猕猴桃种苗，使用带溃疡病病原菌枝条做接穗的几率高，从而加速溃疡病的传播，风险大。目前，我国猕猴桃主产区都发生了溃疡病，很多果园的溃疡病感染率达到50％以上，溃疡病呈蔓延、爆发趋势，给果农和有关农业企业带来了巨大的经济损失，也严重影响了猕猴桃产业的发展。迄今，猕猴桃溃疡病的防治尚无有效方法。药物防治是主要手段，但效果有限。过量使用农药不仅会增加成本，而且还会引起药害，影响果实品质和安全性，导致出口受阻。因此，开发一种培育和生产无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗方法，成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有猕猴桃种苗生产技术存在的缺陷，提供了一种培育和生产无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗方法。在新开辟的果园中种植无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗，可以杜绝通过种苗传播溃疡病、将溃疡病病原菌带入果园，从而可以大大降低果园发生溃疡病的风险、减轻溃疡病的防治压力，节约农药和劳力成本，为生产高质量的有机猕猴桃创造条件。本专利技术是这样实现的：本专利技术目的之一在于提供一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法，所述方法包括如下步骤：步骤1、外植体的选择：采集猕猴桃当年生枝条并消毒，选取带侧芽或顶芽的小段作为外植体；步骤2、芽的形成：将步骤1所得外植体接种在茎段培养基上使其形成芽；步骤3、芽的增殖：将步骤2所得的芽切下并转到芽增殖培养基上进行增殖；所述芽增殖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3～0.5mg/LBA+0.3mg/LGA3；步骤4、芽的快速伸长：将增殖的芽继代到伸长培养基上以促进芽增殖并快速伸长；所述芽伸长培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3mg/LBA+4～5mg/LGA3；步骤5、茎尖培养：分离步骤4所得显著伸长芽的茎尖，在茎尖培养基上诱导出新芽；所述茎尖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/LBA+0.1mg/LNAA或MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.5～0.7mg/LTDZ；步骤6、新芽增殖培养：将步骤5所得各个新芽分别在所述的芽增殖培养基上进行增殖，同一芽增殖所形成的材料构成一个无性系；步骤7、筛选无溃疡病病原菌的无性系并扩繁：对步骤6所得各无性系中的芽进行溃疡病病原菌检测，筛选出无溃疡病病原菌的无性系，并于所述的芽增殖培养基上进行扩繁；步骤8、组培苗的获得：将扩繁得到的芽转到生根培养基上诱导生根，获得完整植株，即得到猕猴桃组培苗；步骤9、组培苗溃疡病病原菌检测与驯化栽培：对步骤9所得到的猕猴桃组培苗再次进行溃疡病病原菌检测，确认无溃疡病病原菌后将猕猴桃组培苗在温室内驯化栽培。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术提供的一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法，先以果园猕猴桃当年生枝条为外植体，诱导并繁殖芽，然后利用赤霉素促进芽快速伸长，再分离伸长芽的茎尖进行脱菌培养、诱导出新芽，通过对各个新芽增殖所形成的芽进行溃疡病病原菌检测，筛选出脱菌成功的芽，最后对脱菌成功的芽进行扩繁、生根和驯化炼苗，获得可在室外栽培的种苗。同现有的嫁接繁殖方法相比，本方法最大的优点是所生产的种苗不带溃疡病病原菌，可以杜绝通过种苗传播溃疡病、将溃疡病病原菌带入果园，从而大大降低果园发生溃疡病的风险、减轻防治压力、节约农药和劳力成本，为生产高质量的有机猕猴桃创造了条件；其次是种苗均匀一致，有利于猕猴桃的标准化、规范化栽培。无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗既可以直接用于建立果园，也可以用于建立嫁接繁殖所需的接穗圃。附图说明图1为实施例1中的无溃疡病病原菌的“红阳”猕猴桃种苗培育过程中的图片；其中A图为未脱菌的“红阳”猕猴桃芽研磨后涂布在LB培养基上的细菌生长情况；B图为“红阳”猕猴桃芽内部细菌转到KB培养基上的生长情况，PSA为标准溃疡病病原菌，箭头所指菌落为疑似PSA；C图为茎尖脱菌培养所形成的新芽；D图为脱菌芽所增殖的芽丛研磨后涂布在LB培养基上培养10天后的情况；E图为脱菌芽的PCR检测，泳道1和13为DNAmarker，泳道2和3为PSA菌，泳道4和5为未脱菌芽，其余泳道(6-12和14-19)为细菌培养检测阴性的芽丛；F图为生根的组培苗；G图为移栽2个月后的组培苗；图2为实施例2提供的无溃疡病病原菌的“华朴3号”猕猴桃种苗培育过程中的图片；其中A图为未脱菌的“华朴3号”猕猴桃芽研磨后涂布在LB培养基上的细菌生长情况；B图为“华朴3号”猕猴桃芽内部细菌转到KB培养基上的生长情况，PSA为标准溃疡病病原菌，箭头所指菌落为疑似PSA；C图为茎尖脱菌培养所形成的新芽；D图为脱菌芽所增殖的芽丛研磨后涂布在LB培养基上培养10天后的情况；E图为脱菌芽的PCR检测，泳道4为DNAmarker，泳道1为PSA菌，泳道2和3为未脱菌芽，泳道5-19为细菌培养检测阴性的芽丛；F图为生根的组培苗；G图为移栽2个月的组培苗；图3为实施例3提供的无溃疡病病原菌的中华猕猴桃雄株M1种苗培育过程中的图片；其中A图为未脱菌的中华猕猴桃雄株M1芽研磨后涂布在LB培养基上的细菌生长情况；B图为中华猕猴桃雄株M1芽内部细菌转到KB培养基上的生长情况，PSA为标准溃疡病病原菌，箭头所指菌落为疑似PSA；C图为茎尖脱菌培养所形成的新芽；D图为脱菌芽所增殖的芽丛研磨后涂布在LB培养基上培养10天后的情况；E图为脱菌芽的PCR检测，泳道9为DNAmarker，泳道7、8、10和11为未脱菌芽，泳道1-6和12-19为细菌培养检测阴性的芽丛；F图为生根的组培苗；G图为移栽的组培苗。具体实施方式实施例1一种无溃疡病病原菌的“红阳”猕猴桃种苗的生产方法，包括如下步骤：步骤1、外植体的选择：S1、外植体采集：在疫区果园内采集当年生枝条。S2、外植体消毒：在实验室内，用自来水和洗涤剂清洗枝条后，在含1％有效氯的次氯酸钠溶液中浸泡15～20min，然后用无菌水漂洗3次。步骤2、芽的形成：在超净工作台上，再将枝条切成约1～2cm长的带侧芽或顶芽的小段，接种在茎段培养基上促进芽的形成。茎段培养基为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n步骤1、外植体的选择：采集猕猴桃当年生枝条并消毒，选取带侧芽或顶芽的小段作为外植体；/n步骤2、芽的形成：将步骤1所得外植体接种在茎段培养基上使其形成芽；/n步骤3、芽的增殖：将步骤2所得的芽切下并转到芽增殖培养基上进行增殖；所述芽增殖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3～0.5mg/L BA+0.3mg/L GA3；/n步骤4、芽的快速伸长：将增殖的芽继代到芽伸长培养基上以促进芽增殖并快速伸长；所述芽伸长培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3mg/L BA+4～5mg/L GA3；/n步骤5、茎尖培养：分离步骤4所得显著伸长芽的茎尖，在茎尖培养基上诱导出新芽；所述茎尖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA或MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.5～0.7mg/L TDZ；/n步骤6、新芽增殖培养：将步骤5所得各个新芽分别在所述的芽增殖培养基上进行增殖，同一芽增殖所形成的材料构成一个无性系；/n步骤7、筛选无溃疡病病原菌的无性系并扩繁：对步骤6所得各无性系中的芽进行溃疡病病原菌检测，筛选出无溃疡病病原菌的无性系，并于所述的芽增殖培养基上进行扩繁；/n步骤8、组培苗的获得：将扩繁得到的芽转到生根培养基上诱导生根，获得完整植株，即得到猕猴桃组培苗；/n步骤9、组培苗溃疡病病原菌检测与驯化栽培：对步骤9所得到的猕猴桃组培苗再次进行溃疡病病原菌检测，确认无溃疡病病原菌后将猕猴桃组培苗在温室内驯化栽培。/n...

【技术特征摘要】
1.一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、外植体的选择：采集猕猴桃当年生枝条并消毒，选取带侧芽或顶芽的小段作为外植体；
步骤2、芽的形成：将步骤1所得外植体接种在茎段培养基上使其形成芽；
步骤3、芽的增殖：将步骤2所得的芽切下并转到芽增殖培养基上进行增殖；所述芽增殖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3～0.5mg/LBA+0.3mg/LGA3；
步骤4、芽的快速伸长：将增殖的芽继代到芽伸长培养基上以促进芽增殖并快速伸长；所述芽伸长培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3mg/LBA+4～5mg/LGA3；
步骤5、茎尖培养：分离步骤4所得显著伸长芽的茎尖，在茎尖培养基上诱导出新芽；所述茎尖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/LBA+0.1mg/LNAA或MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.5～0.7mg/LTDZ；
步骤6、新芽增殖培养：将步骤5所得各个新芽分别在所述的芽增殖培养基上进行增殖，同一芽增殖所形成的材料构成一个无性系；
步骤7、筛选无溃疡病病原菌的无性系并扩繁：对步骤6所得各无性系中的芽进行溃疡病病原菌检测，筛选出无溃疡病病原菌的无性系，并于所述的芽增殖培养基上进行扩繁；
步骤8、组培苗的获得：将扩繁得到的芽转到生根培养基上诱导生根，获得完整植株，即得到猕猴桃组培苗；
步骤9、组培苗溃疡病病原菌检测与驯化栽培：对步骤9所得到的猕猴桃组培苗再次进行溃疡病病原菌检测，确认无溃疡病病原菌后将猕猴桃组培苗在温室内驯化栽培。


2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈永勤，陈琪琪，杨之帆，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42