一种膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用技术方案

本发明专利技术提供一种用于筛查或检测或辅助诊断膀胱癌的方法、试剂盒、系统及应用，可同时针对FGFR3、TERT以及PLEKHS1点突变以及OTX1、NID2、NRN1甲基化水平进行检测，巧妙的实现了基因点突变和甲基化检测联合检测，减少了样本的需求量和实验操作步骤以及检测周期，提高检测的特异性和灵敏度。

A method, kit, system and application of point mutation methylation of bladder cancer driving gene

【技术实现步骤摘要】
一种膀胱癌驱动基因点突变甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用
本专利技术属于基因变异检测
，尤其涉及一种同时针对膀胱癌驱动基因的DNA甲基化和单核苷酸变异的进行检测的方法以及相关试剂盒、系统及应用。
技术介绍
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，居我国男性肿瘤发病率的第6位。其中男性发病率是女性发病率的3-4倍，而女性的死亡率要比男性高。由于手术后需要持续的复查随访及高复发率(非肌层浸润性膀胱的复发率可达60-70％)，使得膀胱癌成为诊治费用最高的成人癌种。预后差和易复发是膀胱癌的重要特点，有效的治疗很大程度上依赖于膀胱癌的早期诊断与早期治疗。然而，膀胱癌发病隐匿，大部分患者都是因为肉眼或镜下血尿才会到医院就诊，而此时已是癌症晚期。所以寻找特异的膀胱癌早期诊断方法具有重要的临床价值。膀胱镜作为膀胱癌诊断的金标准，有高达10％的漏诊率，且为侵入性的检查，接受程度低；尿液细胞学对高级别的膀胱癌有较高的敏感性，对低级别的膀胱癌检出率较低；影像学检测可发现较大的膀胱内肿瘤。但上述传统的膀胱癌检查手段，均无法同时满足无创、且高检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的检测试剂，其包括针对待检区域的模板设计的特异性的引物和探针，所述待检区域包括基因点突变、基因甲基化或其组合。/n

【技术特征摘要】
1.一种针对膀胱癌发生相关通路基因筛查膀胱癌的检测试剂，其包括针对待检区域的模板设计的特异性的引物和探针，所述待检区域包括基因点突变、基因甲基化或其组合。


2.如权利要求1所述的检测试剂，其待检区域包括基因点突变、基因甲基化的组合。


3.如权利要求1、2任一项所述的检测试剂，其基因点突变包括针对FGFR3、TERT以及PLEKHS1中的一种或一种以上组合的点突变。


4.如权利要求1、2任一项所述的检测试剂，其基因甲基化包括针对OTX1、NID2、NRN1中的一种或一种以上组合的甲基化。


5.如权利要求3所述的检测试剂，其针对FGFR3点突变的待检区域为如SEQIDNO：1所示序列；
其针对TERT点突变的待检区域为如SEQIDNO：2所示序列；
其针对PLEKHS1点突变的待检区域为如SEQIDNO：3所示序列。


6.如权利要求4所述的检测试剂，其针对OTX1甲基化的待检区域为如SEQIDNO：4所示序列；
其针对NID2甲基化的待检区域为如SEQIDNO：5所示序列；
其针对NRN1甲基化的待检区域为如SEQIDNO：6所示序列。


7.如权利要求1-6任一项所述的检测试剂，所述引物扩增目标区域的大小为80～150bp。


8.如权利要求7所述的检测试剂，所述引物扩增目标区域的大小为80～100bp。


9.如权利要求1-8任一项所述的检测试剂，所述引物的上游引物或下游引物3’端落在待检测点上。


10.如权利要求9所述的检测试剂，所述待检测点距离上游引物或下游引物3’端0～5碱基。


11.如权利要求1-10任一项所述的检测试剂,所述的引物的3’端倒数第二位、第三位引入0～2碱基错配。


12.如权利要求1-11任一项所述的检测试剂，其引物选自如SEQIDNOs：7-11、13-17、19-23、25-29、31-34、36-39任一所示序列或其组合。


13.如权利要求1-12任一项所述的检测试剂，其探针靠近待检位点。


14.如权利要求1-13任一项所述的检测试剂，其探针连接有报告荧光基团和/或猝灭基团。


15.如权利要求14所述的检测试剂，其报告荧光基团选自FAM、HEX、VIC、ROX中的一种或多种；其猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、Cy3、Cy5中的一种或多种。


16.如权利要求1-15任一项所述的检测试剂，其探针选自如SEQIDNOs：12、18、24、30、35、40所示的任一序列或其组合。


17.如权利要求1-16任一项所述的检测试剂，其针对待检区域的模板设计的特异性的引物选自如下引物对的一种或多种的组合：
针对FGFR3点突变的上下游引物分别为，选自如SEQIDNOs：7-10中的任一序列，以及SEQIDNO：11所示序列；和/或
针对TERT点突变的上下游引物分别为，选自如SEQIDNOs：13-16中的任一序列，以及SEQIDNO：17所示序列；和/或
针对PLEKHS1点突变的上下游引物分别为，选自如SEQIDNOs：19-22中的任一序列，以及SEQIDNO：23所示序列；和/或
针对OTX1甲基化的上下游引物分别为，可选自如SEQIDNOs：25、26中的任一序列，以及SEQIDNOs：27-29所示的任一序列；和/或
针对NID2甲基化的上下游引物分别为，选自如SEQIDNO：31所示序列，以及SEQIDNOs：32-34所示的任一序列；和/或
针对NRN1甲基化的上下游引物分别为，选自如SEQIDNO：36所示序列，以及SEQIDNOs：37-39所示的任一序列。


18.如权利要求1-17任一项所述的检测试剂，其针对待检区域的模板设计的特异性的引物选自如下引物对的一种或多种的组合：
针对FGFR3点突变的上下游引物分别为SEQIDNOs：10、11所示序列；和/或
针对TERT点突变的上下游引物分别为SEQIDNOs：16、17所示序列；和/或
针对PLEKHS1点突变的上下游引物分别为，SEQIDNOs：22、23所示序列；和/或
针对OTX1甲基化的上下游引物分别为SEQIDNOs：25、29所示序列；和/或
针对NID2甲基化的上下游引物分别为SEQIDNOs：31、34所示序列；和/或
针对NRN1甲基化的上下游引物分别为SEQIDNOs：36、39所示序列。


19.如权利要求1-18任一项所述的检测试剂，其针对待检区域的模板设计的特异性的引物、探针选自如下引物对、探针中的一种或多种的组合：
针对FGFR3点突变的上下游引物、探针分别为SEQIDNOs：10、11、12所示序列；和/或
针对TERT点突变的上下游引物、探针分别为SEQIDNOs：16、17、18所示序列；和/或
针对PLEKHS1点突变的上下游引物、探针分别为，SEQIDNOs：22、23、24所示序列；和/或
针对OTX1甲基化的上下游引物、探针分别为SEQIDNOs：25、29、30所示序列；和/或
针对NID2甲基化的上下游引物、探针分别为SEQIDNOs：31、34、35所示序列；和/或
针对NRN1甲基化的上下游引物、探针分别为SEQIDNOs：36、39、40所示序列。


20.如权利要求1-19任一项所述的检测试剂，其检测试剂还包括针对内参基因设计的引物和探针。


21.如权利要求20所述的检测试剂，其内参基因为ATCB。


22.如权利要求20、21任一项所述的检测试剂，其针对内参基因设计的引物和探针如SEQIDNOs:41-43所示序列。


23.如权利要求22所述的检测试剂，其使用的引物、探针的浓度为：
针对FGFR3点突变的上下游引物、探针的浓度分别为25μM，25μM，15μM；和/或
针对TERT点突变的上下游引物、探针的浓度分别为25μM，25μM，10μM；和/或
针对PLEKHS1点突变的上下游引物、探针的浓度分别为25μM，25μM，8μM；和/或
针对OTX1甲基化的上下游引物、探针的浓度分别为25μM，25μM，15μM；和/或
针对NID2甲基化的上下游引物、探针的浓度分别为25μM，25μM，15μM；和/或
针对NRN1甲基化的上下游引物、探针的浓度分别为25μM，25μM，15μM；和/或
针对内参基因的上下游引物、探针的浓度分别为2.5μM，2.5μM，5μM。


24.如权利要求1-23任一项所述的检测试剂，其还包括PCR反应酶、PCR增强剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆利，徐根明，赵谦，
申请(专利权)人：湖南大地同年生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43