一种重组人血小板生成因子原液的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种重组人血小板生成因子原液的制备方法，所述方法包括以下步骤：1)以批次流加培养模式培养rh‑TPO工程细胞；2)将步骤1)培养获得的发酵液采用S/D法灭活；3)将步骤2)灭活后的发酵液依次经过阳离子层析、疏水层析、阴离子层析，得到重组人血小板生成因子原液。采用本发明专利技术的方法制备的重组人血小板生成因子原液纯度大于99.5％～100％，蛋白活性为3.0x10

A preparation method of recombinant human thrombopoietin stock solution

【技术实现步骤摘要】
一种重组人血小板生成因子原液的制备方法
本专利技术属于生物制剂领域，涉及一种重组人血小板生成因子原液的制备方法
技术介绍
上世纪50年代，Kelemen等发现并提出体内存在着一种能够刺激血液中血小板生成的体液因子，并命名为血小板生成因子(Thrombopoietin，TPO)，它对巨核细胞系统的发育和成熟有明显促进作用。重组人血小板生成因子(recombinanthumanthrombopoietin，rh-TPO)是含有332个氨基酸并且经CHO工程菌表达的重组糖蛋白，通过与其特异性受体Mpl结合而调节巨核细胞生长、分化、成熟并分裂形成有功能的血小板，用于治疗包括实体瘤及急性白血病放化疗后、骨髓移植、再障和其他骨髓功能不全及HIV等造成的血小板严重减少和特发性血小板减少性紫癜(ITP)。专利ZL00109612.5公开了重组人血小板生成素特定的培养条件，纯化方法。该方法所使用的纯化方法复杂，细胞培养液需经过超滤，阴离子，凝胶过滤，阳离子，反向层析及凝胶过滤层析繁琐步骤，且最后的培养液40L仅获得260mg蛋白，收率低，不适合规模生产。专利公开号为CN1276382的专利技术公开了一种大规模生产重组人血小板生成素的制剂方法。该方法包括用特殊培养基，在特定培养条件下培养携带有编码人血小板生成素蛋白基因序列的被转化的哺乳动物细胞，以获得该蛋白质产物的高表达收获液。但是其公开的制备生产方法中存在不被现在认可的动植物源性营养培养基α-MEM，且其中添加胎牛血清量为5-20％，采用较为复杂的灌流工艺，灌流速度为每日0.5-15升，包括将终发酵液依次经过超滤、阳离子交换层析、凝胶层析、阴离子交换层析、反相高效液相层析和凝胶过滤层析等。其生产工艺复杂繁琐，收率低，不利于产业化放大。美国专利号NO.5，986，049(ZymoGenetics，Seattle，USA)和美国专利号NO.5，744，587(ZymoGenetics，Seattle，USA.)分别公开了以亲和层析法纯化血小板生成素的方法，前者使用亲和层析和离子交换层析对哺乳动物的血小板生成素进行了纯化，所得TPO纯度达到90％以上。后者以吸附法、亲和层析和疏水层析法制备由BHK细胞表达的人血小板生成素，由700升收获培养基中获得了250毫克蛋白。收率及蛋白纯度太低，不符合要求。因此，当前对可以大规模制备重组人血小板生成因子的工业化的方法存在需求。
技术实现思路
基于现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种大规模制备重组人血小板生成因子的方法。本专利技术提供的方法步骤简单，产量高。不仅解决了当前重组人血小板生成因子生产工艺繁琐，无法规模化生产放大的问题，同时解决重组人血小板生长细胞因子类传统工艺上无法去除脂胞膜和非脂胞膜病毒，如猪源型病毒、牛源型病毒等的问题，具有重要的意义。一方面，本专利技术提供了一种制备重组人血小板生成因子原液的方法，所述方法包括以下步骤：1)使用生物反应器，以批次流加模式培养重组人血小板生成因子(rh-TPO)工程细胞；2)将步骤1)培养获得的发酵液使用S/D法灭活；3)将步骤2)灭活后的发酵液依次经过阳离子层析、疏水层析、阴离子层析，得到重组人血小板生成因子原液。根据本专利技术所述的制备方法，其中，在步骤1)中，所述培养使用的基础培养基为EX-CELLAdvancedTMCHOFed-batch培养基；流加培养基为HyCloneTMCellBoostTM7a和HyCloneTMCellBoostTM7b；优选地，每隔1～3天补加所述流加培养基HyCloneTMCellBoostTM7a和HyCloneTMCellBoostTM7b，其添加量分别为培养体积的4％～6％和0.4％～0.6％；更优选地，每隔2天补加所述流加培养基HyCloneTMCellBoostTM7a和HyCloneTMCellBoostTM7b，其添加量分别为培养体积的5％和0.5％；本专利技术采用的细胞株为江苏康禾生物制药有限公司专利号201310491722.7中所构建好的细胞株。根据本专利技术所述的制备方法，其中，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法实现的：①复苏rh-TPO工程细胞并使用EX-CELLAdvancedTMCHOFed-batch培养基培养至活细胞密度不低于3.0×106个/mL，活力不低于90％；②接种至生物反应器，继续培养至收获；其中，接种的第3、5、7、9天分别补加培养体积的4％～6％和0.4～0.6％的HyCloneTMCellBoostTM7a和HyCloneTMCellBoostTM7b；其中，所述生物反应器为100L生物反应器，并具有如下培养参数：温度35.5±1.5℃；pH6.9±0.5；溶氧30％～70％；优选地，所述100L生物反应器还具有如下培养参数：转速50-80rpm；表层通气10％～30％；深层通气0-0.1lpm；深层氧气0-0.5lpm；深层二氧化碳0-0.4lpm；优选地，培养过程中，葡萄糖浓度为4～7g/L。根据本专利技术所述的制备方法，其中，在步骤2)中，所述S/D法使用的试剂为聚乙二醇辛基苯基醚和磷酸三丁酯；优选地，在步骤2)中，聚乙二醇辛基苯基醚的工作浓度为1％(V/V)；磷酸三丁酯的工作浓度为0.3％(V/V)。根据本专利技术所述的制备方法，其中，所述步骤2)是通过包括以下步骤的方法实现的：在发酵液中边搅拌边加入S/D试剂，用HCl溶液调节pH值至pH6.5，在25℃±2下灭活1h-2h。根据本专利技术所述的制备方法，其中，所述步骤3)中，阳离子层析使用复合型弱阳离子介质MMCDiamond进行；优选地，所述阳离子层析的条件为：上样条件20mM磷酸盐缓冲液、0.1M氯化钠，pH6.5±0.2，电导：11～15ms/cm；清洗条件：1M氯化钠pH6.5；洗脱条件：50mMTrispH8.01MNH4Cl2M尿素。根据本专利技术所述的制备方法，其中，所述步骤3)中，疏水层析使用ButylHP填料进行；优选地，所述疏水层析的条件为：上样条件：20mM磷酸盐缓冲液、0.7～0.8M(NH4)2SO4pH7.0电导：115ms/cm；下样条件：3M(NH4)2SO4，调节电导与上样电导相差±2ms/cm，上样量≤6.4mg/mL介质；清洗条件：20mM磷酸盐缓冲液、0.7M(NH4)2SO4pH7.0；洗脱条件：10mM磷酸盐缓冲液一步洗脱。根据本专利技术所述的制备方法，其中，所述步骤3)中，阴离子层析使用MixAMustang离子交换填料进行；优选地，所述阴离子层析的条件为：上样条件：20mMTris0.1MNaClpH8.0；下样条件：20mMTris、1MNaCl、pH8.0、调节电导为12±2ms/cm，上样量≤2.78mg/mL介质；清洗条本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人血小板生成因子原液的制备方法，所述方法包括以下步骤：/n1)使用生物反应器，以批次流加模式培养重组人血小板生成因子工程细胞；/n2)将步骤1)培养获得的发酵液使用S/D法灭活；/n3)将步骤2)灭活后的发酵液依次经过阳离子层析、疏水层析、阴离子层析，得到重组人血小板生成因子原液。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组人血小板生成因子原液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)使用生物反应器，以批次流加模式培养重组人血小板生成因子工程细胞；
2)将步骤1)培养获得的发酵液使用S/D法灭活；
3)将步骤2)灭活后的发酵液依次经过阳离子层析、疏水层析、阴离子层析，得到重组人血小板生成因子原液。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤1)中，所述培养使用的基础培养基为EX-CELLAdvancedTMCHOFed-batch培养基；流加培养基为HyCloneTMCellBoostTM7a和HyCloneTMCellBoostTM7b。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，每隔1～3天补加所述流加培养基HyCloneTMCellBoostTM7a和HyCloneTMCellBoostTM7b，其添加量分别为培养体积的4％～6％和0.4％～0.6％；
优选地，每隔2天补加所述流加培养基HyCloneTMCellBoostTM7a和HyCloneTMCellBoostTM7b，其添加量分别为培养体积的5％和0.5％。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法实现的：
①复苏重组人血小板生成因子工程细胞，并使用EX-CELLAdvancedTMCHOFed-batch培养基培养至活细胞密度不低于3.0×106个/mL，活力不低于90％；
②接种至生物反应器，继续培养至收获；
其中，接种的第3、5、7、9天分别补加培养体积的4％～6％和0.4～0.6％、的HyCloneTMCellBoostTM7a和HyCloneTMCellBoostTM7b；
其中，所述生物反应器为100L生物反应器，并具有如下培养参数：
温度35.5±1.5℃；pH6.9±0.5；溶氧30％～70％；
优选地，所述100L生物反应器还具有如下培养参数：
转速50-80rpm；
表层通气10％～30％；
深层通气0-0.1lpm；
深层氧气0-0.5lpm；
深层二氧化碳0-0.4lpm；
优选地，培养过程中，葡萄糖浓度为4～7g/L。


5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟正明，秦小强，王一凡，
申请(专利权)人：江苏康禾生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32