去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法，所述方法包括：将重组人血小板生成因子的发酵液使用S/D法灭活病毒；和使用纳米膜过滤纯化后的发酵液以除去病毒。根据本发明专利技术所述的方法，其包括以下步骤：1)培养rh‑TPO工程细胞，获得发酵液；2)将发酵液使用S/D法灭活病毒；3)纯化使用S/D法灭活后的发酵液；4)使用纳米膜过滤纯化后的发酵液，即得。使用本发明专利技术的方法不仅能够去除大量的内源及外源脂胞膜病毒，还可以去除非脂胞膜病毒。使用本发明专利技术的方法，不仅对较为复杂的糖修饰细胞因子类蛋白灭活有效，而且能够将重组人血小板生成因子的蛋白活性保持在较高的水平，不影响成品的质量。

Methods of virus removal and / or inactivation in recombinant human thrombopoietin stock solution

【技术实现步骤摘要】
去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法
本专利技术属于生物制剂领域，涉及一种去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法。
技术介绍
上世纪50年代，Kelemen等发现并提出体内存在着一种能够刺激血液中血小板生成的体液因子，并命名为血小板生成因子(Thrombopoietin，TPO)，它对巨核细胞系统的发育和成熟有明显促进作用。重组人血小板生成因子(recombinanthumanthrombopoietin，rh-TPO)是含有332个氨基酸并且经CHO工程菌表达的重组糖蛋白，通过与其特异性受体Mpl结合而调节巨核细胞生长、分化、成熟并分裂形成有功能的血小板，用于治疗包括实体瘤及急性白血病放化疗后、骨髓移植、再障和其他骨髓功能不全及HIV等造成的血小板严重减少和特发性血小板减少性紫癜(ITP)。在使用CHO工程菌制备重组人血小板生成因子的过程中，需要进行病毒灭活。现有的病毒灭活工艺在血液制品及单克隆抗体中主要有以下几种模式：1、巴氏消毒法：该法适用于较为稳定的白蛋白灭活工艺，对HIV和肝炎病毒灭活是比较成熟的。2、干热法(冻干制剂)：80℃加热72小时，可以灭活HCV、HBV、HIV和HAV等病毒，但应考虑制品的水分，含量对病毒灭活的影响。3、低pH灭活孵放法：免疫球蛋白生产中的低pH(如pH＝4)可灭活几种脂胞膜病毒，灭活条件应考虑pH值，孵放时间、温度，溶液溶质等因素。4、膜过滤方法：该法只用于滤膜的有效直径比病毒小的情况下过滤，该方法不能单独使用，需结合其它方法一起使用。其中，以上第1、2、4的病毒灭活工艺主要适用于血液制剂，单克隆抗体主要适用于第3和第4方法结合使用。目前，对于重组人血小板生成因子类产品，由于糖基化占比较高，占分子大小的30％左右，且相对于单克隆抗体而言，由于糖基化修饰位点和糖型较为复杂，蛋白不稳定等导致目前还没有较为成熟的病毒灭活方法。如，国内的rh-TPO产品主要有沈阳三生的特比奥，于2006年生产上市，鉴于之前法规及行业认知度，蛋白复杂性等条件限制，该产品未能进行潜在病毒的灭活和去除，已不符合现阶段要求。进一步地，现有技术中并未提及对糖基化复杂的，蛋白不稳定的细胞因子类产品进行潜在病毒的灭活及处理，对用药安全造成极大的风险及隐患。因此，当前对用于去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法存在需求。
技术实现思路
基于现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种用于去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法。本专利技术提供的方法步骤简单，同时解决了使用传统方法无法去除的脂胞膜病毒和非脂胞膜病毒，如猪源型病毒、牛源型病毒等的问题，对重组人血小板生成因子的生产和使用具有重要的意义。一方面，本专利技术提供了一种用于去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法，所述方法包括：将重组人血小板生成因子(rh-TPO)的发酵液使用S/D法灭活病毒；和使用纳米膜过滤纯化后的发酵液以除去病毒。根据本专利技术所述的方法，其中，所述S/D法使用的试剂为磷酸三丁酯和曲拉通-100；其中，所述磷酸三丁酯的工作浓度为0.3％±0.03％(v/v)，所述曲拉通-100的工作浓度为1％±0.1％(v/v)。根据本专利技术所述的方法，其中，所述S/D法灭活的条件为：23～27℃下，使用S/D试剂处理至少1小时。优选地，所述S/D法灭活的条件为：25℃下，使用S/D试剂处理4小时。优选地，所述纳米膜过滤为使用Millipore公司的ViresolvePro除病毒过滤膜进行。根据本专利技术所述的方法，其包括以下步骤：1)培养重组人血小板生成因子(rh-TPO)的工程细胞，获得发酵液；2)将发酵液使用S/D法灭活病毒；3)纯化使用S/D法灭活后的发酵液；4)使用纳米膜过滤纯化后的发酵液，即得。根据本专利技术所述的方法，其中，在步骤3)中，所述纯化依次为阳离子层析、疏水层析和阴离子层析。根据本专利技术所述的方法，其中，所述方法进一步包括除菌过滤和/或分装的步骤。申请人发现，在制备重组人血小板生成因子原液中，使用传统工艺进行病毒灭活，无法去除脂胞膜和非脂胞膜病毒，如猪源型病毒、牛源型病毒等，极大的增加了患者的使用风险及用药安全，已不符合现在制药行业规范要求。因此，需要在制备过程中增加脂包膜病毒和非脂胞膜病毒灭活工艺，从而极大降低了因病毒灭活不彻底带来的巨大风险。专利技术人根据国内外相关单克隆抗体灭活工艺及血液制品灭活工艺，及相关法律法规要求，积极探索研究rH-TPO细胞因子类生产工艺中对潜在病毒的灭活方式，经过大量实验摸索，最终完成了细胞因子类较为复杂糖基化修饰，蛋白活性不稳定的病毒去除和灭活的空白领。使用本专利技术的方法不仅能够去除大量的内源及外源脂胞膜病毒，还可以去除非脂胞膜病毒，同时，能够较高的保持蛋白活性，最低的S/D灭活剂残留，对患者用药安全起到了巨大的作用。本专利技术解决了重组细胞因子类产品生产工艺中对潜在病毒的灭活方式，经过大量实验摸索，最终完成了细胞因子类较为复杂糖基化修饰，蛋白活性不稳定的生产工艺中未能有效灭活病毒/去除病毒的空白领域，对今后细胞因子类产品生产工艺中病毒去除及灭活具有一定的指导作用。与现有技术相比，本专利技术给的方法具有以下优点：1.使用本专利技术的方法不仅能够去除大量的内源及外源脂胞膜病毒，还可以去除非脂胞膜病毒。2.使用本专利技术的方法，不仅对较为复杂的糖修饰细胞因子类蛋白灭活有效，而且能够将重组人血小板生成因子的蛋白活性保持在较高的水平，不影响成品的质量。3.使用本专利技术的方法，后续进行离子交换层析分离几乎可全部除去S/D残留物，使产品达到了对人体无害的标准要求，对患者用药安全起到了巨大的作用。4.使用本专利技术的方法，，解决了细胞因子类产品无法灭活潜在病毒的空白，具有重要的生产和实践意义。附图说明以下，结合附图来详细说明本专利技术的实施方案，其中：图1为根据本专利技术的实施例1中使用S/D法灭活后，rh-TPO原液的HPLC图谱；图2为根据本专利技术的实施例1中使用S/D法灭活后，rh-TPO原液的SDSPAGE结果；图3为根据本专利技术的对比例1中使用低pH孵放法灭活后，rh-TPO原液的SDSPAGE结果；图4为根据本专利技术的对比例1中使用低pH孵放法灭活后，如方法1所示疏水层析下样经低pH灭活前的HPLC图谱；图5为根据本专利技术的对比例1中使用低pH孵放法灭活后，如方法1所示疏水层析下样经低pH灭活后的HPLC图谱；图6为根据本专利技术的对比例1中使用低pH孵放法灭活后，如方法2所示阴离子层析下样经低pH灭活前的HPLC图谱；图7为根据本专利技术的对比例1中使用低pH孵放法灭活后，如方法2所示阴离子层析下样经低pH灭活后的HPLC图谱；图8为根据本专利技术的对比例2中发酵液使用低pH孵放法灭活后，rh-TPO原液的SDSPAGE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法，所述方法包括：/n将重组人血小板生成因子的发酵液使用S/D法灭活病毒；和/n使用纳米膜过滤纯化后的发酵液以除去病毒。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于去除和/或灭活重组人血小板生成因子原液中病毒的方法，所述方法包括：
将重组人血小板生成因子的发酵液使用S/D法灭活病毒；和
使用纳米膜过滤纯化后的发酵液以除去病毒。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述S/D法使用的试剂为磷酸三丁酯和曲拉通-100；
其中，所述磷酸三丁酯的工作浓度为0.3％±0.03％(v/v)，所述曲拉通-100的工作浓度为1％±0.1％(v/v)。


3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述S/D法灭活为：在23～27℃下，使用S/D试剂处理至少1小时。


4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述S/D法灭活的条件为：2...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟正明，秦小强，王一凡，
申请(专利权)人：江苏康禾生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32