泛素连接酶Smurf1突变体、编码基因及用途制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种致癌相关蛋白Smurf1蛋白的新位点功能的发现与验证，此新位点突变后导致其蛋白功能的完全丧失。其意义在于Smurf1蛋白该69位点发生突变后会降低Smurf1作为E3连接酶活性的功能，进而抑制肿瘤发生。本发明专利技术进一步拓展和完善了肿瘤研究，为肿瘤的治疗和靶点药物的开发提供了一个新的靶标位点。

Mutant, coding gene and application of ubiquitin ligase Smurf1

【技术实现步骤摘要】
泛素连接酶Smurf1突变体、编码基因及用途
本专利技术涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种影响肿瘤形成的Smurf1蛋白新位点功能认识及其在肿瘤治疗中的应用。
技术介绍
从上个世纪八十年代开始，恶性肿瘤发生率和死亡率呈现逐年上升趋势，已逐步成为人类生命的头号杀手。而且随着世界人口日趋老龄化，恶性肿瘤死亡人数将继续上升。目前，我国恶性肿瘤死亡病例总数占世界的近四分之一。恶性肿瘤对人类健康的危害已经引起我国的重视，针对该疾病的治疗也是医学研究人员和公共卫生部门关注的重要课题。Smad泛素化调节因子1(Smurf1)是一种E3连接酶，能选择性地结合受体调节蛋白Smad家族的成员，并使其泛素化降解，进而调节信号通路。近几年研究发现，Smurf1在肠癌、胰腺癌和前列腺癌等癌症中高表达，表明其可能是肿瘤的一种原癌基因。在前期研究中发现，Smurf1在胶质母细胞瘤(GBM)中大量表达，且与GBM预后相关(图1)。它通过PTEN对肿瘤的发生发挥重要作用。研究表明，Smurf1能泛素化PTEN。Smurf1上调会降低PTEN的活性，导致PI3K信号通路的持续激活，而Smurf1的缺失会显著抑制细胞增殖和肿瘤生长。因此，进一步了解Smurf1的激活可能会发现阻止肿瘤发生的潜在靶点。Smurf1磷酸化修饰是促进其底物泛素化的有效途径。然而，其分子机制尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种能抑制肿瘤形成的Smurf1的突变体。本专利技术的技术方案为：泛素连接酶Smurf1突变体，该突变体由泛素连接酶Smurf1的第69位氨基酸替换为其他任意氨基酸得到，所述泛素连接酶Smurf1的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。进一步地，所述泛素连接酶Smurf1的第69位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。多核苷酸，编码上述所述的泛素连接酶Smurf1突变体。进一步地，该多核苷酸的碱基序列如SEQIDNo.3所示。一种重组载体，包含上述所述的多核苷酸。一种重组宿主细胞，含有上述所述的重组载体或表达上述所述的泛素连接酶Smurf1突变体蛋白。我们验证了Smurf1第69位点突变在不同肿瘤细胞中的抑制功能，如：人胶质母细胞瘤、肺癌、结直肠癌等中的反应。上述所述的突变体、多核苷酸、重组载或重组宿主细胞体在制备治疗肿瘤相关药物上的相关应用。进一步地，所述肿瘤为人胶质母细胞瘤。Smurf1第69位点突变后将影响其功能，我们进行FGFR1体外磷酸化实验，在FGFR1酶处理条件下，发现野生型的Smurf1能够被磷酸化，而Y69突变后，Smurf1不能被磷酸化。因为Smurf1是一个E3泛素连接酶，所以我们进行了体外泛素化实验，观察突变是否影响Smurf1的泛素化，结果表明第69位点氨基酸突变后，Smurf1不能再泛素化；并且FGFR1刺激后能够增强野生型Smurf1的泛素化，而不能增加Smurf1-Y69F的泛素化。进一步研究发现Smurf1第69位点氨基酸突变能抑制Smurf1蛋白活性，削弱其泛素化能力，进而抑制癌症进程。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：Smurf1蛋白在多种肿瘤细胞中高表达，对肿瘤的发生发展发挥重要作用。本专利技术提供的Smurf1蛋白位点突变后，能抑制Smurf1蛋白活性，影响Smurf1泛素化能力，进而抑制癌症发生。本专利技术为肿瘤的治疗和靶点药物的开发提供了一个新的靶标位点。附图说明图1：胶质母细胞瘤患者中Smurf1表达量高的患者生存率较低；图2：突变质粒测序结果(部分)；图3：突变型与野生型质粒对比(部分)；图4：稳转细胞系稳转效果鉴定；图5：稳转细胞系克隆形成实验结果；图6：不同肿瘤的Smurf1第69位点不同突变的稳转细胞系克隆形成实验结果；图7：Smurf1及突变蛋白功能差异鉴定结果。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述。下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：表达载体构建1.实验方法Myc-Smurf1质粒、pET-21a质粒、HA-Ub质粒、慢病毒表达载体PCDH-3HA、慢病毒包装质粒PSPAX2和包膜质粒PMD2G购于Addgene。(1)定点突变(以第69位氨基酸由Y到F突变“Y69F”为例，其他类型突变构建过程类似)将Myc-Smurf1质粒(也可以使用插入有Smurf1的其它质粒)进行定点突变。所述Smurf1的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。具体操作如下：定点突变的引物如下表所示：引物名称引物序列(5’-3’)SEQIDXQ5CACTATGATCTATTTGTTGGGAAAACGSEQIDNo:5XQ6CTGGTTCCACTTTGGGTCCAASEQIDNo:6PCR体系：模板Myc-Smurf1质粒10ng，正向引物XQ5(10μM)1.25μl，反向引物XQ6(10μM)1.25μl，Q5HotStartHigh-Fidelity2XMasterMix(2X)12.5μl，反应体系总体积为25μl。点突变PCR反应条件如下：由此构建Myc-Smurf1-Y69F质粒并通过测序进行鉴定。(2)构建慢病毒表达载体使用Myc-Smurf1质粒、Myc-Smurf1-Y69F质粒构建慢病毒表达载体。通过PCR扩增、纯化PCR产物，回收得到目的片段Smurf1和Smurf1-Y69F。也可以用本领域技术人员知悉的其它手段制备目的片段Smurf1和Smurf1-Y69F(例如人工合成)。双酶切环状质粒PCDH-3HA，回收线性载体PCDH-3HA双酶切体系：PCDH-3HAplasmid3μg，NEB限制性内切酶EcoRI-HF1μl，10×NEBcutsmartBuffer2.5μl，ddH2Otofinalvolume25μl。使用ThermoScientificGeneJETGelExtractionKit(Code#K0691)纯化回收目的片段Smurf1、Smurf1-Y69F和双酶切后的质粒PCDH-3HA，详细操作步骤参照说明书进行。利用VazymeCloneExpressIIKit将Smurf1、Smurf1-Y69F分别和PCDH-3HA进行连接，经过DH5α菌落PCR和双酶切鉴定(NEBEcoRI-HF/XhoI+NEBSacI-HF)获得阳性克隆后，进行测序鉴定。...

【技术保护点】
1.泛素连接酶Smurf1突变体，其特征在于，该突变体由泛素连接酶Smurf1的第69位氨基酸替换为其他任意氨基酸得到，所述泛素连接酶Smurf1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.泛素连接酶Smurf1突变体，其特征在于，该突变体由泛素连接酶Smurf1的第69位氨基酸替换为其他任意氨基酸得到，所述泛素连接酶Smurf1的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.根据权利要求1所述的泛素连接酶Smurf1突变体，其特征在于，所述泛素连接酶Smurf1的第69位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。


3.多核苷酸，编码权利要求1或2所述的泛素连接酶Smurf1突变体。


4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的碱基序列如SEQIDNo.3所示。


5.一种重组载体，包含权...

【专利技术属性】
技术研发人员：董磊，夏琴，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11