【技术实现步骤摘要】
南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法
本专利技术涉及一种南蛇藤提取物的研究方法，具体为南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法。
技术介绍
乙型肝炎病毒，简称HBV,感染人体后导致乙型病毒性肝炎（hepatitisB），是我国传染病死亡的重要原因之一，常伴有肝硬化、肝癌等并发症，病死率高。研究认为，乙型病毒性肝炎与机体免疫应答异常、细胞因子网络活化密切相关。现阶段治疗多以药物抑制HBV的复制和数量的治疗方法为主。巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是一种重要的前炎症因子，主要作用为抑制巨噬细胞的游走移动，促进巨噬细胞在炎症局部浸润、聚集、增生、活化，增强其粘附、吞噬作用，还能促进多种炎症细胞因子的生成。MIF的广泛参与炎症反应和肿瘤生成等，研究表明MIF在乙型肝炎发病机制中起重要作用。南蛇藤素有抗发炎作用，早在清代吴其濬撰写的《植物名实图考》中，就有过“行血气。治无名肿毒”的记载。现研究表明，南蛇藤素在原代肝细胞水平能够抑制HBV-DNA的复制，还可以有效地抑制HBsAg的表达。本实...
【技术保护点】
1. 南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法，其特征在于，该南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法按顺序包括：南蛇藤提取物含药血清的制备过程，人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化过程，乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程，南蛇藤提取物含药血清处理感染了HBV 的人骨髓间充质干细胞的过程，结果检测过程，统计学分析过程；/n所述的南蛇藤提取物含药血清的制备过程包括以下步骤：/n步骤一，将南蛇藤茎切断、粉碎成粉，烘干15kg，用浓度95%乙醇150L提取3小时，重复3次，合并提取液，回收乙醇，浸膏900g加水分散后，石油醚萃取3 次，再用乙酸乙酯萃取...
【技术特征摘要】
1.南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法，其特征在于，该南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法按顺序包括：南蛇藤提取物含药血清的制备过程，人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化过程，乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程，南蛇藤提取物含药血清处理感染了HBV的人骨髓间充质干细胞的过程，结果检测过程，统计学分析过程；
所述的南蛇藤提取物含药血清的制备过程包括以下步骤：
步骤一，将南蛇藤茎切断、粉碎成粉，烘干15kg，用浓度95%乙醇150L提取3小时，重复3次，合并提取液，回收乙醇，浸膏900g加水分散后，石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯层，水洗涤3次，减压浓缩，真空冻干，得南蛇藤茎乙酸乙酯提取物250g，贮存于4℃，每1g提取物相当于60g生药，使用前以含0.5%羧甲基纤维素钠的蒸馏水助悬，
步骤二，取新西兰白兔16只，随机分成药物组及溶媒对照组，灌药前禁食4h，自由饮水；药物组给予南蛇藤提取物20mg/kg·d每天分2次给药，共4天，第4天1次给药，2小时后无菌条件下心室采血，3000/L离心10分钟，共3次，56℃,30min灭活，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，1.5mLEP管分装，于-20℃保存备用；
所述的人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化的过程按顺序包括：
人BMSCs的分离、培养过程，人BMSCs的换液过程，人BMSCs的传代过程，人BMSCs生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程，流式细胞术检测人BMSCs群体含量分布过程，流式细胞术检测人BMSCs表面标志过程，
所述人BMSCs的分离、培养过程包括以下步骤：
步骤一，于髂后上嵴抽取红骨髓2mL，加入100μ/mL肝素0.5mL抗凝，无菌操作台内以2-3mLPBS缓冲液稀释，
步骤二，将稀释液按1：1比例缓慢移入装有人淋巴细胞分离液Ficoll-Paque的离心管中，使其分层明显，2000rpm，离心20min，
步骤三，收集位于界面层呈云雾状的有核细胞层，PBS洗涤，1800rpm，离心15min，
步骤四，弃上清，PBS重复洗涤两次，
步骤五，弃上清，用完全培养液悬浮，以1×105/cm3的密度接种于培养瓶，置于37℃，50mL/LCO2及饱和湿度条件下培养，标记为原代，即P0，
步骤六，视细胞生长情况48小时首次更换培养基，
所述人BMSCs的换液过程包括以下步骤：
步骤一，培养人BMSCs采用含10%V/V胎牛血清的LG-DMEM完全培养基，根据细胞生长状态，每3-4天左右更换一次培养基，
步骤二，换液时，先用巴斯德吸管柔和吹细胞面，把衰老的细胞吹下来，弃用旧培养基，加入3-5mL新的培养基，置于37℃，50mL/LCO2的培养箱中培养，
所述人BMSCs的传代过程，包括以下步骤：
步骤一，显微镜下观察人BMSCs生长状态，当细胞长到80%-90%融合时，需要进行消化、传代，
步骤二，轻晃培养瓶，弃去旧的细胞培养基，用5mLPBS洗涤细胞两次，以去除血清残留，
步骤三，每瓶加入1mL0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液，在37℃消化不超过分钟，在纤维镜下控制消化时间，细胞突起收缩变形即可终止，
步骤四，弃上清，加入3mL完全培养基或胎牛血清终止胰蛋白酶作用，
步骤五，弃上清，用PBS清洗细胞2遍，加入新的完全培养基，轻轻吹打细胞使细胞脱落形成单细胞悬液，
步骤六，根据细胞数量的多少按1:3或更高比例接种于新的培养瓶，接种密度为1.0-2.0×103/cm3,置37℃，50mL/LCO2的培养箱中培养，
所述人BMSCs生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程，包括以下步骤：
步骤一，培养至第5代的人BMSCs,进入对数生长期时，用胰蛋白酶溶液消化，制成单
细胞悬液，细胞计数板计数，
步骤二，将人BMSCs以1×104/cm2的密度接种于24孔培养板中，使各孔中准确接种相同数量的细胞，
步骤三，从接种后第2天起每日的相同时点，分别计数3个孔中的细胞总数，连续计数到第8天，
步骤四，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线，
步骤五，Patterson公式计算细胞在对数生长期倍增时间，即Td=Tlg2/lg(Nt/No)，Td：倍增时间，小时；T:细胞由No增至Nt时所用的时间，小时；N:细胞数，
所述流式细胞术检测人BMSCs群体含量分布过程，包括以下步骤：
步骤一，培养至第5代的人BMSCs进入对数生长期时，用胰蛋白酶溶液消化，制成单细胞悬液，不少于106，
步骤二，PBS洗涤，800rpm，离心6min，2次，
步骤三，弃上清，轻敲离心管使细胞适当分散，缓慢滴加1mL-20℃预冷的70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定24小时，
步骤四，800rpm，离心6min，去除乙醇固定液，PBS洗2次，
步骤五，用0.5mL重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打，防止细胞破碎，
步骤六，加RNase-A约3μL至终浓度约为50μg/mL,37℃水浴消化30min，
步骤七，加PI约400μL至终浓度约为65μg/mL，37℃避光染色30min，
步骤八，用300目，孔径40-50微米，尼龙网过滤，上机检测，
所述流式细胞术检测人BMSCs表面标志过程，包括以下步骤：
步骤一，培养至第5代的人BMSCs，胰蛋白酶溶液消化，PBS重悬成单细胞悬液，计数，根据需要用台盼蓝进行细胞活性检测，
步骤二，1000rpm,离心10min，用适量的PBS缓冲液重悬细胞为1×106个/mL，
步骤三，移入流式管，加入不同一抗，轻轻混匀，不同抗体均设对应的IgG同型对照，
步骤四，避光室温孵育30分钟，
步骤五，加入缓冲液重复洗涤2次，重悬细胞后上流式仪检测，
步骤六，根据同型对照的突光强度设定阴性细胞群阈值，观察每一种单抗的阳性细胞表达率及荧光强度；
所述乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程按顺序包括：感染血清的准备过程，HBV病毒感染人BMSCs的过程，HBV感染后的人BMSCs生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程，HBV感染后的人BMSCs细胞周期的测定过程，HBV感染后的人BMSCs基因组DNA的提取过程，HBV感染后的人BMSCs培养上清液的收集过程，HBV感染后的人BMSCs培养上清液中HBVDNA的提取过程，HBV感染后的人BMSCs合成与分泌HBVDNA的检测过程，地高辛，即digoxigenin，DIG，标记全长DNA探针过程，DNA印记，即Southernblotting，检测感染HBV后的人BMSCs是否合成HBVcccDNA过程，电化学发光法检测感染HBV后的人BMSCs培养上清中是否存在HBsAg和HBeAg的过程，间接免疫荧光检测HBV感染后的人BMSCs是否表达HBcAg的过程，特异性抗体阻断实验的过程，
所述感染血清的准备过程包括以下步骤：
取同时满足下列三项指标的患者乙肝患者血清,采集后超净工作台内0.22微米滤器过滤除菌，分装，-80℃储存备用；
条件一，HBsAg(+),Anti-HBsAg(-),HBeAg(+),Anti-HBeAg(-),HBcAg-Ab-IgG(+)
条件二，HBVDNA:5.4×108copies/mL
条件三，患者之前未接受抗病毒治疗，HCV(-),HIV(-)
所述HBV病毒感染人BMSCs的过程包括以下步骤：
步骤一，处于对数生长期的第5代人BMSCs，在超净工作台里吸净完全培养基，更换无血清无...
【专利技术属性】
技术研发人员：屈正，邵馨怡，邱朋，王梓峄，范睿，
申请(专利权)人：屈正，
类型：发明
国别省市：山东;37
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