本发明专利技术公开了一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR‑Cas系统，包括Cas12。优选地，所述CRISPR‑Cas系统包括Cas12、crRNA、dsDNA和报告RNA链。同时本发明专利技术还公开了所述CRISPR‑Cas系统在制备诊断脊髓性肌萎缩症试剂盒中的用途。本发明专利技术提供的CRISPR‑Cas系统可快速对脊髓性肌萎缩症致病基因SMN1基因的突变情况进行检测，具有特异性和灵敏度高，结果可直观分析，正确率高达100％等优点，非常适用于大规模的临床样本检测。
CRISPR CAS system for the diagnosis of spinal muscular atrophy and its application
The invention discloses a CRISPR \u2011 CAS system for diagnosing spinal muscular atrophy, including cas12. Preferably, the CRISPR \u2011 CAS system includes cas12, crrna, dsDNA and report RNA chains. At the same time, the invention also discloses the use of CRISPR \u2011 CAS system in the preparation of diagnostic spinal muscular atrophy kit. The CRISPR \u2011 CAS system provided by the invention can quickly detect the mutation of SMN1 gene, which is a pathogenic gene of spinal muscular atrophy. It has the advantages of high specificity and sensitivity, intuitionistic analysis of results, and accuracy of up to 100%. It is very suitable for large-scale clinical sample detection.
【技术实现步骤摘要】
一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统及其应用
本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统及其应用。
技术介绍
脊髓性肌萎缩症(SpinalMuscularAtrophy,SMA)，又称脊肌萎缩症，是常染色体隐性遗传性疾病，病理特点是脊髓前角细胞及脑干运动神经核变性，临床表现为进行性肌无力和肌萎缩，患者最终死于呼吸衰竭和肺部感染，居致死性常染色体遗传病第二位。该病在新生婴儿中的发病率约1/6000至1/10000，正常人群的携带率约1/40至1/50。按发病年龄、预后和遗传方式分为四型，儿童型有3上临床型(Ⅰ～Ⅰ型)，Ⅳ型为成人型。研究表明，该病的主要致病基因是运动神经元存活基因1(survivalmotorneuron,SMN1)，定位于5号染色体长臂1区3带。SMN1基因在全身组织中普遍表达，大部分细胞可以耐受低水平的SMN蛋白，但脊髓前角细胞(脊髓运动神经元)无法耐受低水平的SMN蛋白。人类基因组存在一个和SMN1高度同源的SMN2基因，两者的外显子区域只存在两个碱基的差异，分别是7号外显子上的C/T和8号外显子上的G/A。SMN1基因的缺失会导致SMA发生，SMN2基因的缺失不导致SMA发生，但其拷贝数的多少与SMA表型的轻重呈负相关，即SMN2的拷贝数越多，产生的功能SMN蛋白也越多，病情越轻。SMA的常规辅助检查包括肌电图、肌酸磷酸激酶、肌肉活检等，但是SMA的临床变异性大，肌电图在儿童患者易出现不配合检查，活检为有创检查，缺乏特异性易出现误诊。基因诊断能够无创检测致病基因SMN1基因的改变，可以很好地辅助SMA的诊断，用于常规检查或产前诊断。目前，用于SMA基因突变的检测的方法主要包括限制性片段长度多态性、PCR、变性高效液相色谱技术和Sanger测序等，上述方法由于自身的缺点，例如检测周期长，所需仪器昂贵和检测成本高等，并不适用于临床大规模推广使用。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统，其具有特异性、灵敏度和准确率高等优点，成本低，无需特殊装置，可快速检测进行SMA的诊断，非常适用于大规模的临床样本检测。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统，包括Cas12。优选地，所述CRISPR-Cas系统包括Cas12、crRNA、dsDNA和报告RNA链。更优选地，所述crRNA序列如SEQIDNo.1所示；所述dsDNA扩增引物包括如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物；所述报告RNA链序列如SEQIDNo.4所示，且报告RNA链的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团。SEQIDNo.1：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATAGACAAAATCAAAAAGAAGG-3’；SEQIDNo.2：5’-TATAAAGCTATCTATATATA-3’；SEQIDNo.3：5’-AGGTGCTCACATTCCTTAAATTA-3’；SEQIDNo.4：5’-TTATT-3’。优选地，所述crRNA制备方法包括以下步骤：(1)设计并合成序列如SEQIDNo.1所示的crRNA；(2)用T7启动子转录试剂盒对步骤(1)获得的crRNA进行转录，即得所述crRNA。优选地，所述dsDNA制备方法包括以下步骤：(1)提取待检测样本DNA，然后利用如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物进行PCR扩增；(2)PCR扩增产物回收，即得所述dsDNA。优选地，所述Cas12a为FnCas12a，本申请专利技术人经过研究发现，当选择FnCas12a时检测效果更好，灵敏度更高。优选地，所述报告RNA链修饰的荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ，即SEQIDNo.4：5’FAM-TTATT-BHQ13’。本专利技术还提供了所述的诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统在制备脊髓性肌萎缩症诊断试剂盒中的用途。本专利技术提供的CRISPR-Cas系统可用于检测SMN1基因的突变情况，从而判断被检测者是否患脊髓性肌萎缩症，因此，可用于制备脊髓性肌萎缩症诊断试剂盒。本专利技术还提供了一种脊髓性肌萎缩症诊断试剂盒，包含所述的诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统。优选地，所述试剂盒组分在检测体系中的含量为：Cas12a45nM、crRNA67.5nM、dsDNA100ng、报告RNA链125nM。优选地，所述试剂盒的检测程序为：选择报告RNA链5’端修饰的荧光基团对应的激发波长和发射波长，在酶标仪上每隔1min检测一次荧光。本专利技术优选的FAM激发波长为494nm，发射波长518nm；每隔1min检测一次荧光。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的CRISPR-Cas系统可快速检测样本中SMN1基因的突变情况，从而判断被检测者是否患脊髓性肌萎缩症，具有特异性和灵敏度高，结果可直观分析，正确率高达100％等优点，且成本低，无需特殊装置，非常适用于大规模的临床样本检测。附图说明图1为本专利技术所述试剂盒检测SMN1基因突变来诊断脊髓性肌萎缩症时正常人、携带者和患者样本的荧光图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。实施例1本专利技术所述脊髓性肌萎缩症诊断试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包括以下组分：FnCas12a、crRNA、dsDNA和报告RNA链；所述crRNA序列如SEQIDNo.1所示；所述dsDNA扩增引物包括如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物；所述报告RNA链序列如SEQIDNo.4所示，且报告RNA链的5’端修饰有荧光基团FAM，3’端修饰有猝灭基团BHQ1。SEQIDNo.1：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATAGACAAAATCAAAAAGAAGG-3’；SEQIDNo.2：5’-TATAAAGCTATCTATATATA-3’；SEQIDNo.3：5’-AGGTGCTCACATTCCTTAAATTAA-3’。SEQIDNo.4：5’FAM-TTATT-BHQ13’。所述crRNA制备方法包括以下步骤：(1)设计并合成序列如SEQIDNo.1所示的crRNA；(2)用T7启动子转录试剂盒对步骤(1)获得的crRNA进行转录，即得所述crRNA。所述dsDNA制备方法包括以下步骤：(1)提取待检测样本DNA，然后利用如本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统，其特征在于，包括Cas12。/n
【技术特征摘要】
1.一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统，其特征在于，包括Cas12。
2.根据权利要求1所述的诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas系统包括Cas12、crRNA、dsDNA和报告RNA链。
3.根据权利要求1所述的诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述crRNA序列如SEQIDNo.1所示；所述dsDNA扩增引物包括如SEQIDNo.2所示的上游引物和SEQIDNo.3所示的下游引物；所述报告RNA链序列如SEQIDNo.4所示，且报告RNA链的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团。
4.根据权利要求3所述的诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述crRNA制备方法包括以下步骤：(1)设计并合成序列如SEQIDNo.1所示的crRNA；(2)用T7启动子转录试剂盒对步骤(1)获得的crRNA进行转录，即得所述crRNA。
5.根据权利要求3所述的诊断脊...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗良平，唐佳，李旭，马巍，
申请(专利权)人：暨南大学，唐佳，
类型：发明
国别省市：广东;44
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