The expression of Beclin \u2011 1 gene in steroid induced avascular necrosis of femoral head in rabbits was detected by HE staining. The number of empty lacunae in osteocytes and osteoblasts was detected by transmission electron microscopy. The expression of Beclin 1 mRNA and protein was detected by RT \u2011 PCR and Western blotting. The expression of GFP \u2011 Beclin 1 protein was detected by immunofluorescence. The experimental group was injected with 3 \u2011 MA (3 \u2011 methylade) Nine, 3 \u2011 methyladenine) to regulate this biological process, and further explore the pathogenesis of SANFH. Results the expression of Beclin 1 mRNA in SANFH group was higher than that in SANFH group. Western blot: in the first and second week of SANFH group, Beclin1 protein was highly expressed, while in the 3 \u2011 MA treatment group, Beclin1 protein was significantly decreased. Immunofluorescence staining: GFP \u2011 Beclin 1 fusion protein expression in osteocytes and osteoblasts in SANFH group was higher than that in the control group. After 3 \u2011 Ma was given, GFP \u2011 Beclin 1 fusion protein expression was partially decreased.
【技术实现步骤摘要】
自噬基因Beclin-1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法
本专利技术涉及激素股骨头缺血坏死研究领域，特别涉及自噬基因Beclin-1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法。
技术介绍
股骨头缺血性坏死(osteonecrosisofthefemoralhead,ONFH)是由于各种原因导致的股骨头血液供应障碍或者细胞变性，进一步恶化发生股骨头的塌陷、结构改变以及关节功能障碍的一种疾病。ONFH通常分为两大类,即创伤性股骨头坏死和非创伤性股骨头坏死，其中非创伤性股骨头坏死以激素性股骨头缺血性坏死(Steroid-inducedavascularnecrosisoffemoralhead，SANFH)为主。自1957年首次报道以来,该病日益增多，病程较长,病因复杂,容易致残。相关研究显示，激素性股骨头坏死临床治疗极其困难,且效果差,因此又有“不死的癌症”之称。激素导致SANFH具有复杂的生物学过程。因此，探明SANFH的发病机制，仍然是该领域研究的重要内容。我们的前期研究结果表明，激素对股骨头节段血管中PDGF与VEGF的超强...
【技术保护点】
1.自噬基因Beclin-1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一、造模：取5月龄日本大耳白兔36只，体重2.5-3.5kg，标准饮食，单笼饲养；随机分成3组；对照组：单纯肌肉注射生理盐水，2ml/只/次，共4次，间隔一周；SANFH组:肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周；3-MA治疗组：肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周，并于注射甲基强的松龙后随即肌肉注射3-MA2ul/只，共4次，间隔一周；分别将每组实验动物于一周、二周、三周、四周处死，每次处死3只；/n步骤二、标本制作，造模一周、二周、三周、四周...
【技术特征摘要】
1.自噬基因Beclin-1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、造模：取5月龄日本大耳白兔36只，体重2.5-3.5kg，标准饮食，单笼饲养；随机分成3组；对照组：单纯肌肉注射生理盐水，2ml/只/次，共4次，间隔一周；SANFH组:肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周；3-MA治疗组：肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周，并于注射甲基强的松龙后随即肌肉注射3-MA2ul/只，共4次，间隔一周；分别将每组实验动物于一周、二周、三周、四周处死，每次处死3只；
步骤二、标本制作，造模一周、二周、三周、四周后采用耳缘静脉注射空气的方法分别处死实验动物，每次处死3只，相对无菌条件下取出实验动物双侧后肢的股骨头；取一侧股骨头分为三部分进行显微镜观察；另一侧股骨头于-80℃冷冻保存，用于进一步检测Beclin1mRNA与蛋白表达；
步骤三、光镜下组织形态学观察
取石蜡包埋组织块，制成厚4um切片，HE染色，之后将实验切片在光镜下观察，计算空缺骨陷窝百分比；正常空缺骨陷窝率为8％-12％，同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过此数目即提示坏死；
步骤四、透射电镜观察自噬体
包括：(1)固定脱钙；(2)在20℃的条件下对透射电镜标本进行梯度酒精脱水；(3)渗透；(4)包埋聚合；(5)利用LeicaEMUC6超薄切片机制作超薄切片，经染色等处理后在FEITECNAISPIRIT透射电镜下进行标本的观察、分析并摄片；
步骤五、RT-PCR检测细胞内Beclin1mRNA水平
包括如下步骤：
(1)组织mRNA的抽提；
(2)引物设计；
GC含量接近45-55％，上下游引物GC含量要保持接近的原则设计引物；选择长度为18-27bp之间，5'端GC含量较多，3'端AT含量较多的引物；以公式Tm＝4*(G+C)+2*(A+T)-5计算Tm值，Tm接近72℃；最终得到Beclin1的上游引物序列为5’-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3’，下游引物序列为5’-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3’，目的片段为363bp；β-Actin的上游引物序列为5’-ACTCGTCATACTCCTGCT-3’，下游引物序列为5’-GAAACTACCTTCAACTCC-3’，目的片段132bp；
(3)逆转录cDNA；
1)取模板RNA及解冻试剂，涡旋混匀，离心后收集残留于管壁的液体，置于冰上；
2)配制引物溶液：EP管3000rpm离心5分钟；每管加50μlRNase-FreeddH2O，生成储存液，浓度为100μM；取新RNase-Free离心管，取5μl储存液，45μlRNase-FreeddH2O，配制引物工作液，浓度为10μM；
3)按下表所述DNA去除体系配制混合液，完全混匀；简短离心，并置于42℃，孵育3min；然后置于冰上放置；
4)按表2的反转录反应体系配制混合液；
5)将反转录反应中的Mix，加入gDNA去除的反应液中，混匀；
6)42℃，孵育15min；
7)95℃，孵育3min后置于冰上，得到cDNA用于后续实验，或者低温保存；
(4)mRNA的荧光定量PCR
1)室温融化引物、cDNA及解冻试剂，轻轻混匀，离心后收集残留于管壁的液体。cDNA模板稀释10倍使用；
2)按下表配制反应体系
3)将配制好的反应体系移入八连管，每管反应总体积为20μl，短暂离心收集残留在管壁的液体；将八连管放入PCR仪，按下表设置反应程序；
4)数据用仪器ABI7500Fast荧光定量PCR仪原机软件进行分析
步骤六、WesternBlot鉴定蛋白表达量
1组织总蛋白的提取
将实验标本置于研钵中，放入少量液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨，反复三次；取20mg研磨组织，放入200ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟；4℃10,000×g离心15分钟；收集上清，进行下一步的实验；
2细胞总蛋白浓度测定
1)各稀释梯度的BSA蛋白标准液的制备；
2)BCA蛋白定量的工作液的制备：工作液由50份的BCA(A反应液)与1份4％硫酸铜(B反应液)组成；实验有标准品18个孔，样品8个孔，每孔需配置BCA工作液200ul，需量取A反应液5200ul，B反应液104ul，将溶液混合，现配现用；
3)在96孔板中依次加入10ulBSA蛋白标准液，标准孔重复两次；在样品孔中加入1ul待测蛋白样品和9ulPBS，将待测样品稀释；
4)每孔加入200ul配制好的BCA工作液；混匀30s，在37℃孵育30min，其后冷却至室温；酶标仪检测570nm吸光值时各孔的吸光度；比照已知BSA量制作的标准曲线为y＝0.0007x+0.0373，R2＝0.9963；
5)参照标准曲线，根据各样品蛋白的校正吸光值，读出各样品的蛋白浓度，通过体积和稀释度计算原来样品蛋白量；
3SDS-PAGE电泳
1)配制10％分离胶，用移液器将配制好的分离胶缓慢加入装配好的玻璃板中，液面高度距玻璃板的顶端3cm，液面上加一层双蒸水，放置20min至分离胶完全凝固后，见分离胶与双蒸水之间有一折射线；
2)制备5％浓缩胶，滤纸吸去分离胶表面的双蒸水，用移液器将配制好的浓缩胶加入玻璃板至顶端，小心插入梳子，注意不产生气泡，放置20min至浓缩胶完全凝固；
3)电泳槽中加入电泳缓冲液，垂直拔出梳子，据蛋白定量结果计算每孔加入等量蛋白，将蛋白样本和蛋白上样缓冲液按4:1混合，95℃煮沸5min，取出后置于冰上；
4)将分子量蛋白标准3-MAmarker和准备好的蛋白样本依次加入到各个上样孔内；
5)连接电泳仪，80V电压电泳1小时至使溴酚蓝染料接近分离胶顶端，然后调至160V电压电泳1.5-2小时至溴酚蓝接近分离胶底部即停；
4蛋白质转膜
1)取出分离胶，切除多余部分，量取目的蛋白所在的胶面大小，据胶面大小切取一张比分离胶稍大的NC膜，6张大小与凝胶相当的滤纸，与分离胶胶一起浸泡于转膜缓冲液中；NC膜需浸泡于双蒸水中10min后也转移转膜缓冲液中；
2)在承有转膜液的托盘中打开转膜夹，在转膜夹的黑面上依次放置海绵垫、三张滤纸、分离胶、NC膜、三张滤纸、海绵垫，尽量使各层之间没有气泡，然后盖紧转膜夹，放入转膜槽中；
3)倒入转膜液，连接电泳仪，1353-MA转膜1.5小时；
5膜的封闭和抗体孵育
1)取出NC膜，紧贴胶面的膜面为蛋白面，将膜的蛋白面朝上，在承有封闭液的玻璃皿中室温缓慢震摇封闭1h；
2)根据目的蛋白大小，参考标准蛋白3-M...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵振群，刘万林，白锐，龚瑜林，赵爱青，王文选，孟晨阳，
申请(专利权)人：内蒙古医科大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：内蒙;15
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