一种小窝蛋白-1的新用途制造技术

本发明专利技术属于生物大分子技术领域，涉及一种小窝蛋白‑1的新用途，用于对ALI的肺保护的的预后评估，更具体用于制备ALI预后评估试剂或试剂盒。为急性肺损伤的诊治提供基础。

A new application of caveolin-1

The invention belongs to the technical field of biomacromolecule, and relates to a new use of caveolin-1, which is used for the prognosis evaluation of Ali's lung protection, and more specifically for the preparation of Ali prognosis evaluation reagent or kit. To provide the basis for the diagnosis and treatment of acute lung injury.

【技术实现步骤摘要】
一种小窝蛋白-1的新用途
本专利技术属于生物大分子
，涉及一种小窝蛋白-1的新用途。
技术介绍
急性肺损伤(Acutelunginjury，ALI)是由多种原因引起的以弥漫性肺细胞损伤为基础，肺组织结构发生特征性的病理改变，肺水肿和肺微不张为病理特征，迅速影响气体交换功能为临床特点肺部炎症和通透性增加综合征。其病理特点为肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤，表现为广泛肺水肿和微小肺不张。病理生理改变主要是肺内分流增加和肺顺应性下降。临床上表现为低氧血症、呼吸频速和X线胸片出现双肺弥漫性浸润。小窝蛋白-1（cav-1）包括cav-1a和Cav-1β两种亚型，分别由不同mRNA编码合成。其中a亚型在其氨基端额外表达31氨基酸。Cav-1的排列顺序中包含着一个发夹样结构的疏水中心，插入窝膜中心，在模型序列中，一个称为cav脚手架区非常重要，是小窝蛋白二聚体形成的基本条件，也是控制小窝蛋白-1与众多信号链蛋白相互反应的关键区域。已有证据表明，磷酸化的小窝蛋白-1负责细胞信号链的调节等多种生物过程。小窝蛋白-1是肺组织细胞膜上的一个特殊结构，在应力及高氧损伤的调控方面起着十分关键的作用；丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)是哺乳动物细胞中重要的信号转导通路，其中p38MAPK通路在细胞生长、细胞应激、炎症和凋亡等多种病生理过程中起关键作用，引起医学界的广泛关注。但目前还没有发现小窝蛋白-1与ALI有关的相关报道。
技术实现思路
本专利技术本专利技术的目的是针对现有技术的上述空白，提供一种小窝蛋白-1的新用途。具体地，一种小窝蛋白-1的新用途，用于对ALI的肺保护的的预后评估。本专利技术的目的在于提供CAV-1在制备ALI预后评估试剂或试剂盒中的应用。所述肺损伤为内毒素性急性肺损伤。具体实施方式材料与方法主要仪器和试剂PCR扩增仪（Biometra,德国),切片机（Leica,德国),生物显微镜（Nikon80i,日本),JD80l凝胶成像与分析系统和形态学图像分析系统（捷达,江苏)，动静脉穿刺针BD0.7mm(苏州BD医疗器械公司)。LPS（0lll:B4,Sigma,美国)，DEX（江苏恒瑞医药公司，批号：16060132）,TrizoI试剂（Invitrigen,美国),ELISA试剂盒（杭州联科生物公司，批号：70-EK3822/2），RIPA裂解液（碧云天生物技术研究所,上海),AMV逆转录试剂盒、Taq酶、dNTP（Promega,美国),Cav-lPCR引物、TLR-4PCR引物、P38MAPK引物、内参GAPDH引物（上海生工科技公司,上海),兔抗鼠Cav-l多克隆抗体Abcam,英国),免疫组化试剂盒（中杉金桥,北京),其余试剂均为国产分析纯试剂。实验动物分组与模型制备成年清洁健康雄性SD大鼠40只，体重250～300g，由浙江省医学科学院动物实验中心提供[动物使用许可证号:SYXK(浙)2014-0001]，大鼠适应性喂养1周，按随机数字表法分为4组（n=10）：等渗盐水对照组（C组）、右美托咪定组(D组)、内毒素性肺损伤组(L组)和内毒素性肺损伤+右美托咪定治疗组(L+D组)。实验前禁食12h、自由饮水。腹腔注射戊巴比妥钠1.6ml/kg麻醉大鼠后仰卧位固定，行左股静脉置管。参照文献介绍的方法：L组和L+D组经股静脉按8mg/kg注射LPS制备大鼠内毒素性急性肺损伤模型，C组和D组给予等量等渗盐水。D组和LD组注射生理盐水或LPS半小时后注射DEX50μg/kg，随后5μg·kg-1·h-1持续泵注，C组和L组等容量生理盐水持续泵注。标本采集注射LPS或等量等渗盐水6h后放血处死大鼠，取右肺上叶组织行组织病理学和免疫组织化学染色，右肺中叶计算W/D值，余肺组织置液氮中冻存备用。肺组织病理学观察取右肺上叶组织，置于4℃的10%多聚甲醛溶液中固定48h，常规酒精干燥，石蜡包埋，切片(厚度5um)，苏木素-伊红（HE）染色，光镜下根据中性粒细胞浸润、肺泡间隔增宽、肺泡腔内出血、肺泡腔渗出四项指标进行肺损伤病理学评价，按严重程度行弥漫性肺泡损伤标准（DAD）评分(正常或非常轻微改变：0分；轻度：1分；中度：2分；重度：3分；极重度：4分)，4项累计总分即为肺损伤评分。肺组织湿干比值的确定取右肺中叶，立即用滤纸吸尽表面水分、血液，称湿重（W）后，60℃烤箱脱水72h至恒重，称干重（D），计算W/D值。肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性及炎症因子表达水平的检测肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性的检测取液氮冻存的肺组织，在冰生理盐水中用玻璃匀浆管制10%的肺组织匀浆，37℃水浴15min。严格按照ELISA试剂盒说明测定肺组织中MPO活性、TNF-α、IL-6水平。肺组织免疫组织化学染色法测定Cav-l、TLR4、p38MAPK及NF-κB蛋白的表达水平取右肺中叶组织，用10%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察病理切片，按照免疫组化试剂盒说明书操作，采用免疫组织化学染色法检测（SP法）检测大鼠肺组织Cav-l、TLR4、p38MAPK及NF-κB蛋白的表达，在光镜下观测，棕黄色颗粒为阳性产物，每张切片随机观察5个不同的视野，利用病理图像分析系统测得免疫组化反应阳性颗粒的平均吸光度Ａ值，并计算出5个视野Ａ值的均值反映目的蛋白的表达水平。荧光定量-PCR法检测Cav-l、TLR4、p38MAPK及NF-κB的mRNA的相对表达肺组织液氮研磨,Trizol法提取大鼠肺组织总RNA,紫外分光光度计测定RNA浓度。采用两步法RT-PCR试剂盒进行RT-PCR扩增，具体操作严格按试剂盒说明执行。参照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。采用LightCyeler480荧光定量PCR仪(Roche公司，美国)检测各样本的域值循环数(cyclethreshold，CT)值，数据用△CT法计算目的基因的相对表达量，衡量mRNA表达量的相对变化。统计学分析应用SPSS17.0统计软件，计量资料以±s进行表示，组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK法。计数资料采用χ2检验。P﹤0.05为差异有统计学意义。结果DAD评分、W/D、MPO活性比较与C组、D组比较，L组、L+D组DAD评分、W/D、MPO活性均明显升高（P﹤0.05）；与L组比较，L+D组DAD评分、W/D、MPO活性均明显下降（P﹤0.05），C组、D组差异无统计学差异（P＞0.05），见表1。肺组织炎症因子表达水平比较与C组、D组比较，L组、L+D组TNF-α、IL-6均明显升高（P﹤0.05）；与L组比较，L+D组TNF-α、IL-6均明显下降（P﹤0.05）；C组、D组差异无统计学差异（P＞0.05）,见表2。肺组织Cav-l、TLR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小窝蛋白-1的新用途，用于对ALI的预后评估。/n

【技术特征摘要】
1.一种小窝蛋白-1的新用途，用于对ALI的预后评估。


2.根据权利要求1所述一种小窝蛋白-1的新用途，用于制备ALI预...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟志鹏，刘静，陆蕴红，童飞，胡四平，宋鹏涛，曹小飞，黄新华，
申请(专利权)人：湖州市中心医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33