利用CpG位点甲基化水平检测代偿期肝硬化的标志物制造技术

本发明专利技术公开了一种利用CpG位点甲基化水平检测肝硬化的标志物。其用于检测代偿期肝硬化，包括如下甲基化位点：cg05650055,cg08477332,cg17040924,cg17149911,cg20332088,cg24018148，cg01521131,cg01543583,cg02734482,cg10415021,cg12289251,cg12579198,cg15977432,cg16345566,cg18137779,cg23403836,cg23899408,cg26021304。本发明专利技术采用CpG位点甲基化水平变化检测代偿期肝硬化，无需传统肝活检，CT、MRI和其他影像学检查，检测水平可靠性高，开发了一种对人体肝脏无损检测的新方法。

Detection of markers of compensatory cirrhosis by CpG methylation

The invention discloses a marker for detecting liver cirrhosis by using the methylation level of CpG site. It is used to detect compensatory cirrhosis, including the following methylation sites: cg05650055, cg08477332, cg17040924, cg17149911, cg20332088, cg24018148, cg01521131, cg01543583, cg02734482, cg10415021, cg12289251, cg12579198, cg15977432, cg1634566, cg18137779, cg23403836, cg23899408, cg26021304. The invention adopts CpG site methylation level change to detect compensatory cirrhosis without traditional liver biopsy, CT, MRI and other imaging examinations, and has high reliability of detection level. A new method for non-destructive detection of human liver is developed.

【技术实现步骤摘要】
利用CpG位点甲基化水平检测代偿期肝硬化的标志物
本专利技术属于肝病检测
，具体涉及一种利用CpG位点甲基化水平检测代偿期肝硬化的标志物。
技术介绍
慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个普遍和日益严重的全球公共卫生问题，与肝硬化(LC)和肝细胞癌(HCC)密切相关，是导致高发病率和高死亡率的原因。HBV相关肝病也给患者及其家属带来沉重的经济负担。由于肝功能不全和门脉高压，肝硬化患者的发病率很高，失代偿肝硬化患者的5年生存率为14％，而代偿肝硬化患者的5年生存率为84％。临床上，根据腹水、静脉曲张破裂出血、胃肠道出血或肝性脑病等一系列临床症状，或者Child-Turcotte-Pugh(CTP)评分为B级或C级很容易区分代偿肝硬化患者和失代偿肝硬化患者。代偿肝硬化与慢性乙型肝炎(CHB)区分比较困难，目前临床应用CT、MRI和其他影像学检查，在诊断中的都有相应的局限性。明确诊断仍然依靠于肝活检，这是传统的金标准检测，来确诊代偿期肝硬化中纤维化分级。然而，它具有侵害性，存在严重并发症的风险、取样限制性和确诊多样性，因此临床医生一直试图寻找更准确和非侵入性的方式来评估代偿性肝硬化。全基因组DNA甲基化谱能够对所有CpG位点甲基化变化进行监控，可为临床监测肝纤维化进程、检测代偿性肝硬化诊断提供生物标志物。目前，尚未有可靠的代偿期肝硬化标志物发现的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用CpG位点甲基化水平检测肝硬化的标志物及检测方法。一种利用CpG位点甲基化水平检测肝硬化的标志物，用于检测代偿期肝硬化，I类位点包括cg05650055,cg08477332,cg17040924,cg17149911,cg20332088,cg24018148所述代偿期肝硬化患者的甲基化水平比慢性乙型肝炎纤维化s1级,纤维化s2级，纤维化s3级患者和失代偿期肝硬化患者低。II类位点包括cg01521131,cg01543583,cg02734482,cg10415021,cg12289251,cg12579198,cg15977432,cg16345566,cg18137779,cg23403836,cg23899408,cg26021304所述代偿期肝硬化患者的甲基化水平比慢性乙型肝炎纤维化s1级,纤维化s2级，纤维化s3级患者和失代偿期肝硬化患者高。扩增上述利用CpG位点甲基化水平检测肝硬化的标志物的引物。所述利用CpG位点甲基化水平检测代偿期肝硬化的标志物在评估代偿期肝硬化中的应用。所述利用CpG位点甲基化水平检测代偿期肝硬化的标志物在制备检测代偿期肝硬化的试剂盒中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术采用CpG位点甲基化水平变化检测代偿期肝硬化，无需传统肝活检，CT、MRI和其他影像学检查，检测水平可靠性高，开发了一种对人体肝脏无损检测的新方法。附图说明图1为STEM分析结果。图2为LASSO分析Profile24中部分cg位点。图3为LASSO分析Profile26中部分cg位点。图4为cg17149911和cg05650055的焦磷酸测序和450K芯片相关性分析以及其诊断代偿期肝硬化的ROC曲线及AUC。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1本实施例进行队列建设包括CHB纤维化s1级(10例),纤维化s2级(9例)，纤维化≥s3级(9例)，代偿期LC(10例)，失代偿期LC(10例)，共5个阶段，然后用IlluminaHumanMethylation450BeadChip(甲基化450k)芯片通过横断面研究，全基因组范围内筛选区分代偿期标志物。实验样本来源首都医科大学附属北京佑安医院。实验步骤：人外周血单核细胞(PBMC)分离1.BD10mlEDTA真空抗凝采血管采集血液，离心2200rmp,7min，取上清血浆，再注入RPMI-1640培养基至10ml，混合均匀；2.15ml离心管中加入5ml分离液(Axis-Shield),缓慢加入第一步混合物，2200rmp,18min；3.取中间那层白膜至一个新的10ml离心管，加RPMI-1640培养基至15ml，离心1700rpm，10min；4.弃上清，加入2ml冻存液(冻存液为90％血清，10％DMSO)定溶用移液管吹散混匀取200ull放入血浆管中用细胞计数仪计数；5.以1×107cell/支冻存细胞。DNA提取(Qiagen：RNeasyMiniKit)1.均一化：将上述裂解液放入QIAshredderspincolumn中离心，12000-13000rpm，30s；2.将上述裂解液加入gDNAEliminatorspincolumns离心，12000-13000rpm30s,columns上为DNA，将flow-through进行提取RNA；3.向gDNAEliminatorspincolumns中加入500ulRPEbuffer清洗一次，弃上清后，重新离心12000-13000rpm,1min；将columns放置通风处静止2min，确保无乙醇残留；4.加入30ulDNase-freewater静止2min,12000-13000rpm，离心1min；5.质控：ThermoScientificTMNanoDrop测量DNA浓度20-50ng/ul，OD260/OD280在1.8～2.0之间，OD230/OD260的比值应在0.4～0.5之间为合格。转化(EZDNAMethylation-GoldTMKitCatalogNos.D5005&D5006)1.配制转化buffer：每管CTConversionReagent中加入900μl水,300μlM-DilutionBuffer,50μlM-DissolvingBuffer，室温震荡10min完全溶解(其对光很敏感，所以要尽量减少在光下的暴露)；2.每管中加入20ulDNA(200to500ng)，130μlCTConversionReagent,混合均匀后进行反应：98℃for10min,64℃for2.5h,4℃storageupto20h；3.添加600μl的M-BindingBuffer到Zymo-SpinICColumn中，并将柱放如试剂盒所提供的CollectionTube中；4.装填样品(从步骤2)到含有M-BindingBufferZymo-SpinICColumn盖上盖将柱颠倒数次来混合样品；5.全速(>12000rpm)离心30s,去除流出液；6.加入100μl的M-WashBuffer到柱中全速离心30s；7.加入200μl的M-DesulphonationBuffer到柱中并且在室温(20℃-30℃)下放置15-20min.然后全速离心30s；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CpG位点甲基化水平检测代偿期肝硬化的标志物，其特征在于，用于检测代偿期肝硬化，包括如下甲基化位点：cg05650055,cg08477332,cg17040924,cg17149911,cg20332088,cg24018148，cg01521131,cg01543583,cg02734482,cg10415021,cg12289251,cg12579198,cg15977432,cg16345566,cg18137779,cg23403836,cg23899408,cg26021304。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用CpG位点甲基化水平检测代偿期肝硬化的标志物，其特征在于，用于检测代偿期肝硬化，包括如下甲基化位点：cg05650055,cg08477332,cg17040924,cg17149911,cg20332088,cg24018148，cg01521131,cg01543583,cg02734482,cg10415021,cg12289251,cg12579198,cg15977432,cg16345566,cg18137779,cg23403836,cg23899408,cg26021304。


2.根据权利要求1所述利用CpG位点甲基化水平检测代偿期肝硬化的标志物，其特征在于，甲基化位点cg05650055,cg08477332,cg17040924,cg17149911,cg20332088,cg24018148为I类位点，代偿期肝硬化患者的甲基化水平比慢性乙型肝炎纤维化...

【专利技术属性】
技术研发人员：李康，张永宏，李宁，覃岭，李昂，张弛，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京佑安医院，
类型：发明
国别省市：北京;11