一种兔血抗氧化肽的发酵制备方法技术

本发明专利技术提供了一种兔血抗氧化肽的发酵制备方法，其包括步骤：(1)、分别制备枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液；按体积比3:1:1的比例，将枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液混合，得到混合种子液；(2)、以灭菌后的兔血作为培养底物，将混合种子液接种至培养底物中，接种量为2.5～6.5％；(3)、在30～40℃、120‑150r/min转速下，培养2‑4天，对所得培养液进行离心、抽滤和超滤之后，即得抗氧化肽。本发明专利技术所得抗氧化肽对ABTS+、·OH和·O

A fermentation method of rabbit blood antioxidant peptide

【技术实现步骤摘要】
一种兔血抗氧化肽的发酵制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种兔血抗氧化肽的发酵制备方法。
技术介绍
我国是产兔大国，也是世界第一兔产品出口大国[9]，兔血资源非常丰富。健康家兔的血量大约是55-65ml/kg,但由于其血腥味重、适口性差、难消化等原因，导致大量的兔血都被直接丢弃，并未得到充分利用。兔按照经济用途主体划分为三个方向：肉用、毛用和皮用，而未涉及对兔血的回收利用，在屠宰过程中均被废弃。但各类研究证明，兔血有非常大的作用，有学者曾从兔血中分离出治疗失眠的物质。而从兔血中提取抗氧化肽的研究，至今还未见报道。肽是由两个或两个以上氨基酸组成的结构简单、生理活性强的物质，具有调节人体新陈代谢、增强机体免疫力、预防疾病等功能。抗氧化肽是生物活性肽的一种，可以通过它的主要功能特性对其进行定义为：可以维持机体自由基平衡、提高机体抗衰老、抑制脂质过氧化和清除自由基、抗疾病功能的一类生物活性肽，统称为抗氧化肽。此外，抗氧化肽还有抗癌、抗应激、抗血压等作用。目前，按不同的分类，抗氧化肽可分为多种，如动物源抗氧化肽，植物源抗氧化肽，微生物性抗氧化肽，内源性与外源性抗氧化肽。动物源抗氧化肽来源于动物蛋白质，可分为内源性与外源性两种，是从动物自身组织器官产生的或体内蛋白质水解物中获得的具有抑制大分子过氧化或清除体内自由基作用的物质。目前，用于制备动物源抗氧化肽的来源主要为各种海源、乳源、血源、禽蛋源等。动物蛋白源抗氧化肽在食品和生物体中表现出了有效的抗氧化活性(如清除自由基、抑制油脂氧化和螯合金属离子等)。目前，在本领域中，一个亟待解决的问题是如何利用发酵法从兔血中高效的提取出抗氧化肽。
技术实现思路
针对现有技术的不足及需求，本专利技术的目的在于提供一种利用发酵法高效的从兔血中提取出抗氧化肽，使得所得抗氧化肽具有优异的ABTS自由基清除率。为了实现上述目的，本专利技术提供的方案如下：一种兔血抗氧化肽的发酵制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)、分别制备枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液；按体积比3:1:1的比例，将枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液混合，得到混合种子液；(2)、以灭菌后的兔血作为培养底物，将混合种子液接种至培养底物中，接种量为2.5～6.5％；(3)、对步骤(2)所得物，在30～40℃、120-150r/min转速下，培养2-4天，然后对所得培养液进行离心、抽滤和超滤之后，即得抗氧化肽。作为本专利技术一个可选实施方案，所述枯草芽孢杆菌种子培养液是将活化好的枯草芽孢杆菌斜面菌种单菌落接种入灭菌后的种子液体培养基中，于35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，所述种子培养液体培养基的配方为：葡萄糖10g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，pH＝7.0。作为本专利技术一个可选实施方案，所述凝结芽孢杆菌种子培养液是将活化好的凝结芽孢杆菌斜面菌种单菌落接种入灭菌后的种子液体培养基中，于35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，所述种子培养液体培养基的配方为：葡萄糖6g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、磷酸一氢钾2g/L、七水硫酸锰1g/L，pH＝7.0。作为本专利技术一个可选实施方案，所述植物乳杆菌种子培养液是将活化好的植物乳杆菌斜面菌种单菌落接种入灭菌后的种子液体培养基中，于35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，所述种子培养液体培养基的配方为：葡萄糖20g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、磷酸一氢钾2g/L、七水硫酸锰0.25g/L、柠檬酸三钠3g/L，pH＝7.0。所述兔血的浓度为6-14g/mL。作为本专利技术一个优选方案，所述兔血的浓度为10g/mL。作为本专利技术一个优选方案，所述混合种子液的接种量为4.5％。作为本专利技术一个优选方案，步骤(3)中，对步骤(2)所得物，在37℃、135r/min转速下，培养3.5天。作为本专利技术一个优选方案，步骤(3)中，进行离心时，用高速冷冻离心机进行离心，离心参数为：温度为4℃、转速为6000r/min、时间20min。作为本专利技术一个优选方案，步骤(3)中，进行抽滤时，利用0.45μm滤膜过滤；进行超滤时，利用5KD滤膜于离心机进行，离心参数为：温度4℃，转速4000r/min，时间10min。在本专利技术之前，有《枯草芽孢杆菌发酵牦牛血制备抗氧化肽工艺优化》、《牦牛血抗氧化肽制备方法对比及分离纯化研究》曾利用枯草芽孢杆菌从牦牛血中提取抗氧化肽，并取得了良好的结果。本专利技术在上述报道技术的基础上，对兔血进行了相应的实验，也获得了一定的效果，但总体而言，所得抗氧化肽对于ABTS+的清除率仍未能尽如人意，多肽含量较低。在利用枯草芽孢杆菌作为发酵菌的基础上，本专利技术专利技术人将凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌进行混菌发酵，但是对于所得抗氧化肽的ABTS+清除率和多肽含量并没有明显提升。经过大量的摸索，专利技术人发现将枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌三者混合进行混菌发酵，可以大幅度的提升发酵所得抗氧化肽对于ABTS+的清除率和多肽含量。除此之外，专利技术人还发现，本专利技术的混菌发酵所得抗氧化肽还可以大幅度的提升对于·OH和·O2-自由基的清除。因此，本专利技术对于本领域的贡献在于提供了一种可以利用兔血制备具有高抗氧化性的抗氧化肽的方法。在获得上述实验结果的基础上，本专利技术的专利技术人利用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行混菌发酵，发现所得抗氧化肽的对于ABTS的清除率相对于利用枯草芽孢杆菌进行单菌发酵所得的抗氧化肽并没有提升。因此，可以确定，枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌活菌和植物乳杆菌在进行发酵时，对于所得抗氧化肽的抗氧化性和多肽含量起到了协调增效的作用。本专利技术的有益效果：1、本专利技术所得的抗氧化肽对于ABTS自由基的清除率可达到94％，具有优异的ABTS自由基清除效果。2、本专利技术制备方法制备得到的多肽含量高，多肽含量可达到3.42mg/ml。3、本专利技术所得抗氧化肽对于·OH自由基的清除率可达到89.31％、对于·O2-自由基的清除率可达到91.27％。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本专利技术进行进一步的说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述
技术实现思路
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。实施例11.1实验材料枯草芽孢杆菌：SICC.197.四川省微生物资源平台菌种保藏中心凝结芽孢杆菌：CGMCCNo.6729中国普通微生物菌种保藏管理中心植物乳杆菌：CGMCCNo.5105中国普通微生物菌种保藏管理中心1.2实验试剂lowry法蛋白浓度试剂盒：北京索莱宝科技有限公司国产化学分析纯：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、氯化钠、葡萄糖、琼脂、ABTS、K2S2O8、三氯乙酸(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种兔血抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n(1)、分别制备枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液；按体积比3:1:1的比例，将枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液混合，得到混合种子液；/n(2)、以灭菌后的兔血作为培养底物，将混合种子液接种至培养底物中，接种量为2.5～6.5％；/n(3)、对步骤(2)所得物，在30～40℃、120-150r/min转速下，培养2-4天，然后对所得培养液进行离心、抽滤和超滤之后，即得抗氧化肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种兔血抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)、分别制备枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液；按体积比3:1:1的比例，将枯草芽孢杆菌种子培养液、凝结芽孢杆菌种子培养液和植物乳杆菌种子培养液混合，得到混合种子液；
(2)、以灭菌后的兔血作为培养底物，将混合种子液接种至培养底物中，接种量为2.5～6.5％；
(3)、对步骤(2)所得物，在30～40℃、120-150r/min转速下，培养2-4天，然后对所得培养液进行离心、抽滤和超滤之后，即得抗氧化肽。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌种子培养液是将活化好的枯草芽孢杆菌斜面菌种单菌落接种入灭菌后的种子液体培养基中，于35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，所述种子培养液体培养基的配方为：葡萄糖10g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，pH＝7.0。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌种子培养液是将活化好的凝结芽孢杆菌斜面菌种单菌落接种入灭菌后的种子液体培养基中，于35℃，转速135r/min的恒温振荡培养箱中培养12h，所述种子培养液体培养基的配方为：葡萄糖6g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、磷酸一氢钾2g/L、七水硫酸锰1g/L，pH＝7.0。
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【专利技术属性】
技术研发人员：肖岚，辛松林，董平，李燮昕，安攀宇，
申请(专利权)人：四川旅游学院，
类型：发明
国别省市：四川;51