HPV分型检测用的核酸组合物及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种HPV分型检测用的核酸组合物、检测芯片及其制作方法、检测试剂盒及其使用方法。该HPV分型检测用的核酸组合物，包括PCR扩增引物和检测探针。其中，PCR扩增引物包括用于扩增HPV病毒L1区的变异区域的病毒PCR扩增引物对。所述检测探针包括14个序列或互补序列中含有分别如SEQ ID NO:1～14所示序列的病毒寡核苷酸探针。该HPV分型检测用的核酸组合物针对HPV病毒L1区的变异区域设计病毒PCR扩增引物对，因而，一次PCR扩增就能将含有14个高危型HPV的变异区域的目标片段扩增出来，再针对各HPV类型设计特异性的病毒寡核苷酸探针，一次扩增就能检测14个HPV亚型，整个检测过程简单，高效。

Nucleic acid composition for HPV typing and its application

The invention relates to a nucleic acid composition, a detection chip, a production method, a detection kit and a use method for HPV typing detection. The nucleic acid composition for HPV typing detection includes PCR amplification primer and detection probe. Among them, PCR amplification primers include a pair of virus PCR amplification primers for amplifying the variation region of HPV L1 region. The detection probe comprises 14 sequences or complementary sequences containing virus oligonucleotide probes with sequences as shown in SEQ ID No: 1-14 respectively. The nucleic acid composition for HPV typing and detection is designed to design a virus PCR amplification primer pair for the mutation region of HPV L1 region, so that the target fragments containing 14 high-risk HPV mutation regions can be amplified by one-time PCR amplification, and then the specific virus oligonucleotide probes for each HPV type can be designed, and 14 HPV subtypes can be detected by one-time amplification, the whole detection process is simple and efficient \u3002

【技术实现步骤摘要】
HPV分型检测用的核酸组合物及应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体是涉及一种HPV分型检测用的核酸组合物及应用，尤其是涉及一种HPV分型检测用的核酸组合物、检测芯片及其制作方法、检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒(HPV)是一种含有约8000个碱基对的双链环状DNA病毒，有100多种类型，是一类致瘤病毒。根据致瘤程度分为高危型HPV和低危型HPV，其中至少14种可引起癌症(又称高风险类型，即高危型)，常在宫颈瘤中检出，严重威胁广大妇女的身体健康，其长期感染是导致宫颈癌变的重要原因。长期感染是一个渐进的过程，早期感染清除能减少或避免癌变，也能对症治疗，特别是在目前发病率日益增高且呈年轻化的趋势的情况下，HPV的筛选、预防、诊断和治疗是一个急需解决的问题。世界卫生组织早在2015年3月发布的实况报导第380号《人乳头状瘤病毒和宫颈癌》中就指出“人乳头状瘤病毒(16型和18型)引起70％的宫颈癌和宫颈癌癌前病变，估计2012年有44.5万个新发病例，占全球新发病例的84％。2012年，约有27万妇女死于宫颈癌，其中85％以上发生在低收入和中等收入国家。”美国癌症学会2016年报告“美国女性子宫宫颈癌以7％发病率排行第四，死亡率排行第五”。我国也早将宫颈癌筛查列入癌症筛查与早期发现项目，在全国开展普查筛选。早期对宫颈癌的筛查与诊断，主要采用形态学的检查，例如巴氏涂片、液基细胞学(LCT、TCT)、组织蜡片等。感染了HPV病毒的上皮细胞可出现形态学上的改变，但也会有部分出现未确定意义的非典型鳞状上皮细胞(ASCUSS)，从而出现假阴性结果，需要结合其它检测或分子生物学技术检测HPV病毒感染。分子生物学技术检测包含几种常用的方法：核酸分子杂交如southern杂交、northern杂交、原位杂交等，灵敏度较高，但操作步骤较复杂，要求较高，临床应用较少；核酸扩增PCR荧光检测，灵敏度较高，操作简单，但高灵敏度容易导致假阳性，仪器设备价格较高，难以普及；杂交捕获法，通过特定探针直接检测样本病毒，不用经过PCR扩增，但检测仅能显示是否感染HPV不能进行分型；基因芯片法，在PCR扩增的基础上加入探针芯片法，可同时检测多个分型，成本较低，易于推广，但是步骤繁琐，检测背景深，容易出现假阳或假阴，技术需要加以改进；微流控全自动核酸检测系统，结合多种检测技术可实现多种分子诊断实验室功能，全自动，全封闭，多检测，但多功能结合，其具体的灵敏度、准确率有待实验验证。目前市面上的HPV检测产品种类多，大多采用PCR荧光或杂交与其他技术结合的方式，但不同技术间的结合还存在灵敏度、背景、效率的问题，难以对HPV进行准确分型。因此研制和开发一种能同时检测多个分型HPV病毒的检测产品显得尤为重要。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种HPV分型检测用的核酸组合物、检测芯片及其制作方法、检测试剂盒及其使用方法。一种HPV分型检测用的核酸组合物，包括PCR扩增引物和检测探针；所述PCR扩增引物包括用于扩增HPV病毒L1区的变异区域的病毒PCR扩增引物对；所述检测探针包括14个序列或互补序列中含有分别如SEQIDNO:1～14所示序列的病毒寡核苷酸探针。在其中一个实施例中，所述病毒PCR扩增引物对的序列分别如SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示。在其中一个实施例中，所述PCR扩增引物还包括对照PCR扩增引物对，所述检测探针还包括对照寡核苷酸探针；所述对照PCR扩增引物对用于扩增人管家基因的一序列片段；所述对照寡核苷酸探针能够与由所述对照PCR扩增引物对扩增得到的产物形成的其中一寡核苷酸链互补配对。在其中一个实施例中，所述检测探针的5’端还含有序列如SEQIDNO:20所示的连接序列片段。一种HPV分型检测用的检测芯片，包括芯板、载体以及上述任一实施例所述的HPV分型检测用的核酸组合物中的检测探针；所述芯板具有芯槽，所述载体位于所述芯槽内，所述检测探针固定于所述载体上，且不同的检测探针固定于所述载体的不同区域。在其中一个实施例中，所述检测探针与所述载体的表面经过共价结合的方式连接。一种HPV分型检测用的检测芯片的制作方法，包括如下步骤：在检测探针的5’端以及载体的表面分别修饰形成第一连接基团和第二连接基团，所述第一连接基团能够与所述第二连接基团共价结合；将5’端标记有所述第一连接基团的检测探针与表面修饰有所述第二连接基团的载体进行共价连接反应，使所述检测探针固定于所述载体的表面；将固定有所述检测探针的载体固定在芯板的芯槽中。一种HPV分型检测用的试剂盒，包括PCR扩增引物和上述任一实施例所述的HPV分型检测用的检测芯片，所述PCR扩增引物的下游引物的5’端连接有连接物。在其中一个实施例中，所述HPV分型检测用的试剂盒还包括核酸提取试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂、杂交洗涤试剂、酶杂交试剂、酶洗涤试剂以及显色试剂中的至少一种。一种上述任一实施例所述的HPV分型检测用的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：配制PCR反应液，并进行PCR扩增反应；将PCR扩增反应的产物与所述检测芯片上的检测探针进行杂交反应；对杂交反应后的产物进行显色反应。上述HPV分型检测用的核酸组合物针对HPV病毒L1区的变异区域设计病毒PCR扩增引物对，因而，一次PCR扩增就能将含有14个高危型HPV的变异区域的目标片段扩增出来，再针对各HPV类型设计特异性的病毒寡核苷酸探针，一次扩增就能检测14个HPV亚型，整个检测过程简单，高效。尤其是，本专利技术的病毒寡核苷酸探针在5’端连接有序列为“ATACAAA”(SEQIDNO:20)的连接序列片段，通过在该连接序列片段的5’端修饰氨基等第一连接基团，以与具有第二连接基团的载体进行共价连接反应，将病毒寡核苷酸探针固定在载体上。该连接序列片段的长度及序列结构是研究人员经过创造性的实验设计获取的，以在保证与载体稳定连接的同时，减少后续杂交反应位阻，提高杂交效率。附图说明图1为一具体实例中检测芯片的俯视示意图；图2为图1中载体上不同检测探针的分布示意图，其中G代表GAPDH，表示对照组，其他数字代表HPV亚型；图3为使用图1所示的检测芯片进行阴性样本检测的鲁米诺发光的检测结果，图中亮点表示形成可见光点；图4为使用图1所示的检测芯片进行HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52以及HPV56的阳性样本的鲁米诺发光的检测结果，图中亮点表示形成可见光点；图5为使用图1所示的检测芯片进行HPV58、HPV59、HPV66以及HPV68的阳性样本的鲁米诺发光的检测结果，图中亮点表示形成可见光点。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HPV分型检测用的核酸组合物，其特征在于，包括PCR扩增引物和检测探针；/n所述PCR扩增引物包括用于扩增HPV病毒L1区的变异区域的病毒PCR扩增引物对；/n所述检测探针包括14个序列或互补序列中含有分别如SEQ ID NO:1～14所示序列的病毒寡核苷酸探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种HPV分型检测用的核酸组合物，其特征在于，包括PCR扩增引物和检测探针；
所述PCR扩增引物包括用于扩增HPV病毒L1区的变异区域的病毒PCR扩增引物对；
所述检测探针包括14个序列或互补序列中含有分别如SEQIDNO:1～14所示序列的病毒寡核苷酸探针。


2.如权利要求1所述的HPV分型检测用的核酸组合物，其特征在于，所述病毒PCR扩增引物对的序列分别如SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示。


3.如权利要求1所述的HPV分型检测用的核酸组合物，其特征在于，所述PCR扩增引物还包括对照PCR扩增引物对，所述检测探针还包括对照寡核苷酸探针；
所述对照PCR扩增引物对用于扩增人管家基因的一序列片段；
所述对照寡核苷酸探针能够与由所述对照PCR扩增引物对扩增得到的产物形成的其中一寡核苷酸链互补配对。


4.如权利要求1～3中任一项所述的HPV分型检测用的核酸组合物，其特征在于，所述检测探针的5’端还含有序列如SEQIDNO:20所示的连接序列片段。


5.一种HPV分型检测用的检测芯片，其特征在于，包括芯板、载体以及如权利要求1～4中任一项所述的HPV分型检测用的核酸组合物中的检测探针；所述芯板具有芯槽，所述载体位于所述芯槽内，所述检测探针固定于所述载体上，且不同的检测探针固定于所述载...

【专利技术属性】
技术研发人员：李必松，范静彦，徐秀菊，罗琪，
申请(专利权)人：广州鸿琪光学仪器科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44