用于检测猪塞内卡谷病毒与圆环3型病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供用于检测塞内卡谷病毒与猪圆环3型病毒的双重PCR引物、方法及试剂盒。本发明专利技术根据猪塞内卡谷病毒与猪圆环3型病毒的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，并通过引物筛选以及反应体系优化，建立单管同步检测塞内卡谷病毒与猪圆环3型病毒的双重PCR检测试剂盒。试剂盒具备快速简便、特异性强、灵敏度高、可靠性好的特点，同时可进行批量样本分析，一次反应便能鉴别诊断样本是否存在塞内卡谷病毒与猪圆环3型病毒的感染情况，为猪塞内卡谷病毒与猪圆环3型病毒疫情的监测与防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。

Double PCR primers, detection methods and kits for detection of swine Seneca Valley virus and circovirus 3

The invention provides a double PCR primer, a method and a kit for detecting Seneca Valley virus and porcine circovirus 3. The invention designs Double PCR primers according to the highly conserved specific sequence of swine Seneca Valley virus and swine circovirus 3, and establishes a double PCR detection kit for simultaneous detection of Seneca Valley virus and swine circovirus 3 by primer screening and reaction system optimization. The kit is fast, simple, specific, highly sensitive and reliable. It can be used for batch sample analysis at the same time. One reaction can identify whether there is infection of Seneca Valley virus and porcine circovirus 3 in the diagnosis sample. It can provide strong technical support for the monitoring and prevention of the epidemic situation of swine Seneca Valley virus and porcine circovirus 3, and has good application Prospects.

【技术实现步骤摘要】
用于检测猪塞内卡谷病毒与圆环3型病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒
本专利技术属于动物疫病检测
，具体涉及用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型的双重PCR引物、方法及试剂盒。
技术介绍
塞内卡谷病毒A(SenecavirusA,SVA)是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)Senecavirus病毒属的典型代表。Hales等通过对SVV-001遗传序列进行分析后将Senecavirus列为小RNA病毒科的新的病毒属(Halesetal.,2008)，为无囊膜的单股正链RNA。SVV最初被认为是细胞培养物中的污染物，推测其来源于猪的胰酶或胎牛血清(Reddyetal.,2007)。到2007年，一批自加拿大运往美国明尼苏达州的猪鼻镜出现水泡，蹄部冠状带溃烂等类似水疱病症状，经检测排除口蹄疫、水泡性口炎病和猪水疱病，最终通过PCR检测确定为SVA阳性(PasmaTetal.,2008)。2014年11月，巴西也出现猪群感染SVA的报道。2015年3月，在我国广东某猪场的猪发生跛行，出现鼻镜水泡，送检水泡液、水泡皮、脚皮样品，检测结果显示猪口蹄疫、猪水疱病病原均阴性。继而查找资料，确定发病猪群感染SVA。随后在2015年10月、11月及2016年1月、2月陆续在其他猪场发现猪群感染SVA病例。猪圆环病毒(porcinecircovirus，PCV)为圆环病毒科圆环病毒属的一种小而无囊膜、二十面体对称、环状、共价闭合的单股DNA病毒。病毒粒子直径平均为17nm，以滚环方式进行复制，是目前发现的最小的无囊膜DNA病毒。Brain、Allan等认为可根据猪圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列可将猪圆环病毒分成两种基因型，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物鉴定，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcinecircovirusassociateddiseases，PCVAD)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道综合征(PRDC)、母猪繁殖障碍症、增生性肠炎、坏死性间质性肺炎、仔猪先天性震颤等，表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。近来，一种新型的猪圆环病毒3型病毒在美国首次被报道，该病毒基因组全长2.0kb，其基因编码两个主要蛋白：Cap蛋白和Rep蛋白，两者在核酸链上处于相反方向，其能引起猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍、心脏和多系统炎症等症状。由于SVA和PCV3都是新发病，目前检测SVA和PCV3的常用检测方法主要有病毒分离、血清学检测以及PCR检测等。但病毒分离、血清学检测方法费时费力、敏感性低且容易出现假阳性。而PCR检测的方法主要以某一病毒类型的单一检测为主，不能进行多种病毒类型的联合PCR检测，并且检测灵敏性与特异性也参差不齐。在2108年6月采集的有水泡症状的病料当中有检测到SVA和PCV3的存在，由于PCV3感染易导致猪群免疫抑制，使猪病防控防治更加复杂与困难，从而影响猪场的生产效益。因此在检测SVA的同时检测PCV3，有助于启发疾病防控的新思路，同时利于猪病的防控。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型的双重PCR引物、方法及试剂盒，该试剂盒快速简便、特异性强、灵敏度高、可靠性好，且检测成本低廉，对检测仪器以及操作人员的水平要求不高，同时具备较高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出SVA和PCV3的微量潜伏感染，从而尽早实施正确的治疗方案，挽回经济损失。为此，本专利技术第一方面提供用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的双重PCR引物，所述引物根据猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，其中，猪塞内卡谷病毒的检测引物，由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪圆环3型病毒的检测引物，由SEQIDNO：7所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：8所示的核苷酸序列的反向引物组成。本专利技术第二方面提供用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的双重PCR检测方法，包括以下步骤：1)从待检样品中提取核酸；2)以步骤1)所得核酸为扩增模板，利用如权利要求1所述的双重PCR引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。在本专利技术一实施例中，所述用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的双重PCR反应体系总体积为50μL，包括：1)10μM的SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8所示核苷酸序列各0.5-2.0μL；2)10×PCRBuffer5.0μL；3)dNTPMixture4.0μL；4)rTaqDNA聚合酶1.0μL；5)RNasefreeddH2028.0-34.0μL；6)待测样品的DNA模板4.0μL。在本专利技术一实施例中，所述用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的双重PCR反应体系中，10μM的SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示核苷酸序列的加入量为0.7μL，即其反应浓度为0.14μM；10μM的SEQIDNO：7、SEQIDNO：8所示核苷酸序列的加入量为1.4μL，即其反应浓度为0.28μM。在本专利技术一实施例中，所述用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的双重PCR反应条件包括：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环结束后；72℃终延伸10min。在本专利技术一实施例中，所述的用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的双重PCR检测方法，其检测灵敏度可达102拷贝/μL。本专利技术第三方面提供一种用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环病毒3型病毒的双重PCR检测试剂盒，包括如本专利技术第一方面所述的检测猪塞内卡谷病毒和圆环病毒3型病毒的双重PCR引物，还包括10×PCRbuffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、阳性质控品、阴性质控品。在本专利技术一实施例中，所述的用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的双重PCR检测试剂盒，其检测灵敏度可达102拷贝/μL。在本专利技术一实施例中，所述的用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环病毒3型病毒的双重PCR检测试剂盒可特异性检测鉴定猪塞内卡谷病毒和圆环病毒3型病毒，不能检测出猪流行性腹泻病毒、猪水泡病病毒、水疱性口炎病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒中的一种或多种。本专利技术第四方面提供如本专利技术第一方面所述的双重PCR引物、如本专利技术第二方面所述的双重PCR检测方法或如本专利技术第三方面所述的双重PCR检测试剂盒在猪塞内卡谷病毒和圆环病毒3型病毒检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。本专利技术的有益本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的双重PCR引物，其特征在于，所述引物根据猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，其中，猪塞内卡谷病毒的检测引物，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪圆环3型病毒的检测引物，由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的反向引物组成。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的双重PCR引物，其特征在于，所述引物根据猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，其中，猪塞内卡谷病毒的检测引物，由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪圆环3型病毒的检测引物，由SEQIDNO：7所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：8所示的核苷酸序列的反向引物组成。


2.用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的双重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从待检样品中提取核酸；
2)以步骤1)所得核酸为扩增模板，利用如权利要求1所述的双重PCR引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；
3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。


3.如权利要求2所述的检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的双重PCR检测方法，其特征在于，所述双重PCR的反应体系总体积为50μL，包括：
1)10μM的SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8所示核苷酸序列各0.5-2.0μL；
2)10×PCRBuffer5.0μL；
3)dNTPMixture4.0μL；
4)rTaqDNA聚合酶1.0μL；
5)RNasefreeddH2028.0-34.0μL；
6)待测样品的DNA模板4.0μL。


4.如权利要求2所述的用于检测猪塞内卡谷病毒和圆环3型病毒的双重PCR检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺东生，蔡蔚游，梁伟放，俞丽，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44