用于一次性HIV基因型耐药检测的简并引物组及其应用制造技术

本发明专利技术提供了用于HIV基因型耐药检测的简并引物组及其应用，涉及病毒检测技术领域，所述简并引物组包括逆转录PCR引物、巢氏PCR扩增引物和测序通用引物；所述逆转录PCR引物包括WC‑pol‑F和WC‑pol‑R；所述巢氏PCR扩增引物包括WC‑nest‑F和WC‑nest‑R；所述测序通用引物包括HBX2‑3017R、HBX2‑3785R和HBX2‑4561R。本发明专利技术所述简并引物组适用于中国流行的大多数HIV‑1毒株基因型耐药检测，可一次性扩增HIV病毒蛋白酶‑逆转录酶‑整合酶的基因编码区，与常规方法比成本更低、检测速度更快，同时检测成功率更高。

Degenerate primer set and its application in the detection of drug resistance of HIV genotypes

The invention provides a degenerate primer set for HIV genotypic resistance detection and its application, which relates to the technical field of virus detection. The degenerate primer set includes a reverse transcription PCR primer, a nested PCR amplification primer and a sequencing universal primer; the reverse transcription PCR primer includes WC \u2011 pol \u2011 F and WC \u2011 pol \u2011 R; the nested PCR amplification primer includes WC \u2011 nest \u2011 F and WC \u2011 nest \u2011 R; and the sequencing general The primers included hbx2-3017r, hbx2-3785r and hbx2-4561r. The degenerate primer set of the invention is applicable to the genotypic resistance detection of most HIV \u2011 1 strains prevalent in China, and can amplify the gene coding region of HIV protease \u2011 reverse transcriptase \u2011 integrase once, which is lower cost, faster detection speed and higher detection power compared with the conventional method.

【技术实现步骤摘要】
用于一次性HIV基因型耐药检测的简并引物组及其应用
本专利技术涉及病毒基因型检测
，尤其涉及用于一次性HIV基因型耐药检测的简并引物组及其应用。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus,HIV)攻击人类免疫系统，严重威胁人类生命健康。HIV耐药突变株的出现，不仅使得患者抗病毒治疗的效果下降，死亡病例增加；更重要的是，耐药毒株的流行将带来严重的公共卫生问题。为此，检测HIV基因型耐药突变是非常必要的。HIV-1基因组全长约9kb，为单链反义RNA病毒，其中pol区编码蛋白酶、逆转录酶和整合酶，从2357nt到5095nt，是引起耐药突变的主要区域。当前，几家公司有成熟的商品化检测试剂盒，比如ViroSeq，TRUEGENE,Geneship等，但都仅仅检测蛋白酶和部分逆转录酶区，而且价格昂贵，预计单次检测在人民币2000元以上。在临床上，为了节省成本，主要采用“In-house”的方法:提取待检者血浆中游离的病毒RNA，然后逆转录PCR成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增和巢氏PCR扩增，纯化回收PCR产物，目的片段经Sanger测序，将序列在StanfordUniversityDrugResistanceDatabase里比对，得到相应的耐药突变位点。随着整合酶抑制剂的使用，整合酶耐药突变毒株也开始出现。因此，临床上又需要开展整合酶编码基因的突变检测。但是，至今为止，蛋白酶-逆转录酶区和整合酶区的检测都是单独进行的，要分别至少进行一次逆转录PCR反应和普通PCR扩增。这意味着HIV基因型耐药检测需要两次逆转录PCR反应和两次PCR扩增，费钱费时。这样的缺点在临床检验部门处理大量样本时尤其突出。HIVRNA在复制过程中，由于没有校正(proofreading)功能，会产生大量序列变异。这样就导致单一的引物在遇到不同亚型(subtype)的HIV毒株时，无法与模板结合，导致逆转录PCR或者巢氏PCR扩增失败。而且，由于整个过程步骤多，中间产物无法检测，在失败时，只能从头开始重复实验，甚至重新提取RNA，大大增加成本。另外，在常规Sanger测序时，由于单一引物不能结合模板，而导致测序失败。检测结果不能及时报告，使得临床医生没有耐药数据，在更换抗病毒治疗方案时非常困惑。因此，非常有必要重新设计和优化针对不同亚型的PCR引物和测序引物。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有的HIV基因型耐药检测失败率高、检测成本高、检测时间长的缺陷，提供了一种新的用于HIV基因型耐药检测的简并引物组和试剂盒以及检测方法，利用本专利技术提供的简并引物组可一次性扩增HIV的蛋白酶-逆转录PCR酶-整合酶的编码基因，降低了临床检测成本、节约时间，增加了检测成功率。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了用于一次性HIV基因型耐药检测的简并引物组，包括逆转录PCR引物、巢氏PCR扩增引物和测序通用引物；所述逆转录PCR引物包括WC-pol-F和WC-pol-R；所述WC-pol-F的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述WC-pol-R的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述巢氏PCR扩增引物包括WC-nest-F和WC-nest-R；所述WC-nest-F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述WC-nest-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述测序通用引物包括HBX2-3017R、HBX2-3785R和HBX2-4561R；所述HBX2-3017R的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；所述HBX2-3785R的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述HBX2-4561R的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；SEQIDNO.2～4所示的核苷酸序列中的R为A或G。优选的，所述简并引物组能够检测的HIV亚型包括但不限于：A、B、B’、C、CRF01_AE、CRF02_AG、CRF_07BC、CRF_08BC、CRF_BC、CRF_07BC/08BC、CRF01_AE/B、CRF01_AE/07BC和CRF01_AE/B’/C。优选的，所述WC-pol-R、WC-nest-F或WC-nest-R中，R为A的特定引物与R为G的特定引物的数量比为1:1。本专利技术还提供了上述技术方案所述简并引物组在HIV基因型耐药检测中的应用。本专利技术还提供了一次性HIV基因型耐药检测试剂盒，包括前述技术方案所述的简并引物组。本专利技术还提供了利用前述技术方案所述简并引物组制备一次性HIV基因型耐药检测所需DNA样品的方法，包括以下步骤：(1)从待测样品中提取HIVRNA，得到待测RNA；(2)以所述简并引物组中的逆转录PCR引物对所述待测RNA进行一步法逆转录PCR，得到待测DNA；(3)以所述待测DNA为模板，利用所述简并引物组中的巢氏PCR引物对进行巢氏PCR扩增，得到待测的DNA样品。(4)对所述待测的DNA样本，利用所述简并引物组中的测序通用引物、WC-nest-F以及WC-nest-R进行Sanger测序，得到待分析的DNA序列。优选的，步骤(2)中，所述逆转录PCR的反应条件包括：50℃30min，94℃2min，94℃30s、62℃30s、72℃2min，30个循环，72℃10min。优选的，步骤(2)中，所述逆转录PCR过程中，逆转录PCR引物在反应体系中的浓度为0.4μM。优选的，步骤(3)中，所述巢氏PCR扩增的反应条件包括：94℃3min，94℃30s、58℃30s、72℃1min，30个循环，72℃10min。优选的，步骤(3)中，所述巢氏PCR扩增过程中，巢氏PCR扩增引物在反应体系中的浓度为0.4μM。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：1、在全球的HIV-1流行亚型中，A亚型、B亚型、C亚型、CRF02_AG和CRF01_AE重组型占到所有流行亚型的84％。中国HIV-1流行最广泛的毒株为CRF01_AE、CRF07_BC重组型，以及B’亚型。本专利技术将上述HIV病毒亚型的序列进行多序列比对寻找到不同亚型的保守区域。在保守区域设计引物，可以实现对不同HIV亚型进行扩增以及对扩增产物进行Sanger测序。2、随着整合酶抑制剂的应用，对HIV亚型关于整合酶区域耐药性的检测也至关重要。本专利技术提供的简并引物可一次性扩增得到含有“蛋白酶-逆转录酶-整合酶”编码基因的DNA片段，可实现更为全面的对HIV基因型耐药检测的需求。3、本专利技术通过优化逆转录PCR引物和巢氏扩增引物，在关键位置引入了混合碱基(R)，以确保变异时，引物总能与模板退火进行逆转录PCR。更重要的是，通过本专利技术设计的简并引物组，可直接一次性扩增蛋白酶-逆转录酶-整合酶编码区。这样的片段可以进行sanger测序从而拿到HIV基因型耐药突变信息。4、相对于常规“in-house”技术分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于HIV基因型耐药检测的简并引物组，包括逆转录PCR引物、巢氏PCR扩增引物和测序通用引物；/n所述逆转录PCR引物包括WC-pol-F和WC-pol-R；/n所述WC-pol-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；/n所述WC-pol-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；/n所述巢氏PCR扩增引物包括WC-nest-F和WC-nest-R；/n所述WC-nest-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；/n所述WC-nest-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；/n所述测序通用引物包括HBX2-3017R、HBX2-3785R和HBX2-4561R；/n所述HBX2-3017R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；/n所述HBX2-3785R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；/n所述HBX2-4561R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；/nSEQ ID NO.2～4所示的核苷酸序列中的R为A或G。/n

【技术特征摘要】
1.用于HIV基因型耐药检测的简并引物组，包括逆转录PCR引物、巢氏PCR扩增引物和测序通用引物；
所述逆转录PCR引物包括WC-pol-F和WC-pol-R；
所述WC-pol-F的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
所述WC-pol-R的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
所述巢氏PCR扩增引物包括WC-nest-F和WC-nest-R；
所述WC-nest-F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
所述WC-nest-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
所述测序通用引物包括HBX2-3017R、HBX2-3785R和HBX2-4561R；
所述HBX2-3017R的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；
所述HBX2-3785R的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
所述HBX2-4561R的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；
SEQIDNO.2～4所示的核苷酸序列中的R为A或G。


2.根据权利要求1所述的简并引物组，其特征在于，所述简并引物组能够检测的HIV亚型包括但不限于：A、B、B’、C、CRF01_AE、CRF02_AG、CRF_07BC、CRF_08BC、CRF_BC、CRF_07BC/08BC、CRF01_AE/B、CRF01_AE/07BC和CRF01_AE/B’/C。


3.根据权利要求1或2所述的简并引物组，其特征在于，所述WC-pol-R、WC-nest-F或WC-nest-R中，R为A的特定引物与R为G的特定引物的数量比为1:1。


4.权利要求1～3任意一项所述简并引物组在H...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，胡志亮，王卫晓，
申请(专利权)人：南京市第二医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32