一种功能基因组克隆子库的测序方法技术

本发明专利技术公开了一种功能基因组克隆子库的测序方法。本发明专利技术结合Sanger测序和PacBio测序，利用Sanger测序快读高效获取每个克隆子置信度高的端部序列，同时利用PacBio测序的大容量和不受GC含量影响的测序优势，获取克隆子混合库的准确序列，然后以端部序列与PacBio测序得到的序列库进行比对，对应得到每个阳性克隆子的序列。本发明专利技术提高了测序效率，节约了测序成本，缩短了测序周期，是一种可以更好满足功能基因筛选研究需要的测序方法。

A sequencing method of functional genomic clone library

The invention discloses a sequencing method of a functional genomic clone library. The invention combines Sanger sequencing and pacbio sequencing, uses Sanger sequencing quick reading to efficiently obtain the end sequence with high confidence of each clone, at the same time uses pacbio sequencing's advantages of large capacity and unaffected by GC content to obtain the accurate sequence of the Mixed Library of clones, and then compares the end sequence with pacbio sequencing's sequence library to obtain each positive clone The sequence. The invention improves the sequencing efficiency, saves the sequencing cost, shortens the sequencing cycle, and is a sequencing method which can better meet the needs of functional gene screening research.

【技术实现步骤摘要】
一种功能基因组克隆子库的测序方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种功能基因组克隆子库的测序方法。
技术介绍
功能基因组学提供了一种不任何假设发现新功能基因的方法。但是传统功能基因组学克隆子测序往往依赖一代Sanger测序，这种测序策略是依赖PCR的体外扩增，而这种测序策略基本上不适合高GC含量的克隆子库，这种库可能来自GC的全基因组库，也可能来自环境基因组中的高GC片段。关于高GC含量DNA序列的PCR存在的困难已经有很多报道，尽管通过一些技术可以克服，比如高保真酶或添加剂，但是这些技术一来昂贵，二来仍然不能实现高通量。这对于功能基因筛选，尤其是来自规模宏大的、资源异常丰富的宏基因组是极大的挑战。Sanger测序在面对高GC片段时往往无法胜任，但仅针对片段序列端部的测序是可行的，在测序的速度和价格上是可以满足研究要求的。随着基因组研究的不断推进，以PacBio测序为代表的第三代基因测序技术逐渐应用到多个科研领域。该平台利于单分子实时测序技术，又称作SMRT(SingleMoleculeReal-Time)测序，基于纳米小孔的单分子读取技术，无需扩增即可快速完成序列读取。PacBioSequel测序仪是美国太平洋生物技术公司(PacificBiosciences)基于PacBioRSII平台的基础上，最新推出的第三代测序平台，该系统以测序通量高、单Gb数据成本低、周期短而突出于RSII平台。PacBio测序虽然具有众多优点，但对于功能基因组的克隆子库的测序却适用性不高，一是费用昂贵，二是对于混合样品库无法有效标识。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提出了一种功能基因组克隆子库的测序方法。一种高GC含量功能基因组克隆子库的测序方法，按照下列步骤进行：步骤一、将高GC含量功能基因组克隆子库分为相同的两组样品，分别进行Sanger测序和PacBio测序，所述功能基因组克隆子的GC含量大于75％；进行Sanger测序的实验组，对于每一个质粒样品分别测序；进行PacBio测序的实验组，首先通过限制性内切酶进行线性化，将线性化的质粒混合后，通过PacBio测序一次性得到混合质粒样品的序列库；步骤二、在步骤一所述Sanger测序得到的序列中去除空载体质粒的序列，通过测序的置信度，保留可信的部分，以得到每个克隆子的端部序列；步骤三、将步骤二所述的端部序列(>10bp)与步骤一种所述PacBio测序得到的序列库进行比对，对应得到每个克隆子的序列。在上述技术方案中，在上述步骤一中，所述功能基因组克隆子库是指将经筛选得到的阳性克隆子导入大肠杆菌扩增后，经提取含有阳性克隆子的质粒，由于片段存在GC含量不适于PCR，故采用体内扩增的方法得到适宜测序浓度的质粒DNA。在上述技术方案中，在上述步骤一中，所述用于线性化的限制性内切酶在质粒上仅存在一个切割位点。在上述技术方案中，在上述步骤一中，所述混合质粒样品的序列库的容量通过下列公式计算：测序容量＝理论库容条数×测序深度×单条序列长度(1)在上述技术方案中，在上述步骤二中，所述端部序列的长度为>10bp，参照通用引物的长度为宜。在上述技术方案中，在上述步骤三中，所述序列比对采用通用BLAST方法。在上述技术方案中，在上述步骤三之后，在完成测定该微生物全基因组的基础上，将所得到功能基因片段同时与环形全基因组进行比对，以进一步核对这些片段的精确性。一种功能基因组克隆子库的测序方法，按照下列步骤进行：步骤一、将功能基因组克隆子库分为相同的两组样品，分别进行Sanger测序和PacBio测序；进行Sanger测序的实验组，对于每一个质粒样品分别测序；进行PacBio测序的实验组，首先通过限制性内切酶进行线性化，将线性化的质粒混合后，通过PacBio测序一次性得到混合质粒样品的序列库；步骤二、在步骤一所述Sanger测序得到的序列中去除空载体质粒的序列，通过测序的置信度，保留可信的部分，以得到每个克隆子的端部序列；步骤三、将步骤二所述的端部序列(>10bp)与步骤一种所述PacBio测序得到的序列库进行比对，对应得到每个克隆子的序列。上述所述一种功能基因组克隆子库的测序方法不局限于针对高GC含量，利用该方法可在提高功能基因组库效率的同时有效降低测序费用。本专利技术的优点和有益效果为：现有技术中，Sanger测序在面对高GC片段时往往无法胜任，但仅针对片段序列端部的测序是可行的，在测序的速度和价格上是可以满足研究要求的；而PacBio测序对于功能基因组的克隆子库的测序却适用性不高，一是费用昂贵，二是对于混合样品库无法有效标识。本专利技术结合Sanger测序和PacBio测序，利用Sanger测序快读高效获取每个克隆子置信度高的端部序列(>10bp)，同时利用PacBio测序的大容量和不受GC含量影响的测序优势，获取克隆子混合库的准确序列，然后以端部序列(>10bp)与PacBio测序得到的序列库进行比对，对应得到每个阳性克隆子的序列。本专利技术提高了测序效率，节约了测序成本，缩短了测序周期，是一种可以更好满足功能基因筛选研究需要的测序方法。附图说明图1为本专利技术所述一种结合Sanger测序和PacBio测序的高GC含量功能基因组克隆子库的测序方法的工作流程图。图2为重组质粒和线性化重组质粒的凝胶电泳图谱，A是质粒的凝胶电泳图谱，B是经HindIII切割后质粒的凝胶电泳图谱，C是Xbal切割后质粒的凝胶电泳图谱。图3为Cd抗性菌落液滴测定。横向：pUC118：转化空pUC118质粒的大肠杆菌DH5ɑ作为对照，从x29到x28分别表示包含x29到x28质粒的大肠杆菌DH5ɑ；数排：0、10-1、10-2、10-3、10-4表示培养菌株的初始OD600nm值。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的技术方案。实施例一、提取宏基因组样品采集自于2017年1月采集自石家庄栾城，一处未经氮肥施用的小麦、玉米种植土壤中，利用CTAB法提取其宏基因组。二、构建宏基因组文库本方法采用pUC19质粒和大肠杆菌DH5ɑ进行基因组文库的构建。首先，利用限制酶BamHI(NewEnglandBiolabs,USA)对pUC19质粒进行酶切，然后使用虾碱性磷酸酶脱去末端磷酸。对于宏基因组DNA，利用限制酶Sau3AI(NewEnglandBiolabs,USA)进行酶切，形成DNA片段。将DNA片段(长度为1-8kb)凝胶电泳后，使用QIAquickgelextractionkit进行片段的胶回收，回收的片段与pUC19质粒采用T4连接酶过夜连接反应。10μL连本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高GC含量功能基因组克隆子库的测序方法，其特征在于：按照下列步骤进行：/n步骤一、将高GC含量功能基因组克隆子库分别进行Sanger测序和PacBio测序，所述功能基因组克隆子的GC含量大于75％；/n进行Sanger测序的实验组，对于每一个质粒样品分别测序；/n进行PacBio测序的实验组，首先通过限制性内切酶进行线性化，将线性化的质粒混合后，通过PacBio测序一次性得到混合质粒样品的序列库；/n步骤二、在步骤一所述Sanger测序得到的序列中去除空载体质粒的序列，通过测序的置信度，保留可信的部分，以得到每个克隆子的端部序列；/n步骤三、将步骤二所述的端部序列与步骤一种所述PacBio测序得到的序列库进行比对，对应得到每个克隆子的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种高GC含量功能基因组克隆子库的测序方法，其特征在于：按照下列步骤进行：
步骤一、将高GC含量功能基因组克隆子库分别进行Sanger测序和PacBio测序，所述功能基因组克隆子的GC含量大于75％；
进行Sanger测序的实验组，对于每一个质粒样品分别测序；
进行PacBio测序的实验组，首先通过限制性内切酶进行线性化，将线性化的质粒混合后，通过PacBio测序一次性得到混合质粒样品的序列库；
步骤二、在步骤一所述Sanger测序得到的序列中去除空载体质粒的序列，通过测序的置信度，保留可信的部分，以得到每个克隆子的端部序列；
步骤三、将步骤二所述的端部序列与步骤一种所述PacBio测序得到的序列库进行比对，对应得到每个克隆子的序列。


2.根据权利要求1所述的一种高GC含量功能基因组克隆子库的测序方法，其特征在于：在上述步骤一中，所述功能基因组克隆子库是指将经筛选得到的阳性克隆子导入大肠杆菌扩增后，经提取含有阳性克隆子的质粒。


3.根据权利要求1所述的一种高GC含量功能基因组克隆子库的测序方法，其特征在于：在上述步骤一中，所述用于线性化的限制性内切酶在质粒上仅存在一个切割位点。


4.根据权利要求1所述的一种高GC含量功能基因组克隆子库的测序方法，其特征在于：在上述步骤一中，所述混合质粒样品的序列库的容量通过下列公式计...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小方，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32