用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法技术

本发明专利技术公开一种用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，包括以下步骤：从来自受试者的生物样本中提取宿主基因组DNA，并将其打断至主峰为800bp‑4kb的片段；利用探针组对得到的片段中进行第一检测获得目标序列；对获得的目标序列进行预处理以提高检测灵敏度；和基于电信号测序技术在不进行PCR扩增的情况下对目标序列进行第二检测，从而确认HPV在宿主基因组的整合位点。本发明专利技术的方法能够快速、及时分析HPV病毒存在于宿主细胞内的状态判断，具有显著的临床应用优势，应用本方法在无需错误纠正分析的情况下即可更有效地判断HPV的整合信息。

A method for detecting the integration site of HPV in host genome

The invention discloses a method for detecting the integration site of HPV in the host genome, which comprises the following steps: extracting the host genome DNA from the biological sample from the subject and breaking it to the segment with the main peak of 800bp-4kb; first detecting the obtained segment with the probe group to obtain the target sequence; preprocessing the obtained target sequence to improve the detection spirit Sensitivity; and based on the electrical signal sequencing technology in the absence of PCR amplification on the second detection of the target sequence to confirm the integration site of HPV in the host genome. The method of the invention can quickly and timely analyze the state judgment of the presence of HPV virus in the host cell, and has significant clinical application advantages. The application of the method can more effectively judge the integrated information of HPV without error correction analysis.

【技术实现步骤摘要】
用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法
本专利技术涉及病毒整合位点的检测，具体地涉及用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法。
技术介绍
HPV病毒整合入人基因组是引发癌症发生的重要过程事件，目前对该过程的了解还比较有限，越来越多的研究表明HPV整合是作为分子诊断和个体化治疗的潜在分子标志物，也是非常有价值的预后指标。对于HPV整合的研究方法目前多应用基于二代测序技术的探针捕获方法获得。例如，CN107739761A公开了一种HPV分型及整合的高通量测序检测方法。该方法选取目前HPV亚型的基因，结合第二代高通量测序技术，更全面的检测患者感染HPV的类型，克服了传统检测方法准确率低、假阳性高、重复性差、漏诊率高等困难。在分子诊断领域，最直接而明确的技术是基因测序，第二代高通量测序技术比目前多采用经典的Sanger测序方法有检通量更大、测序速度更快、精确度更高、成本更低和信息量更丰富等优点。该方法在第二代高通量测序技术帮助下，可以对高危型HPV及低危型HPV进行精确分型并检测其是否发生人类基因组的整合，对检测者进行精确地个体化评估，预防病变发生的风险，从而预防肿瘤的发生。虽然基于二代测序的捕获技术比较成熟，但都针对于短片段DNA的探针捕获或者目的片段扩增，并且二代测序读长较短且灵敏性太高，极易导致假阳性结果，而且二代方法仅对断点位置进行检出，对于长序列的整合结构很难鉴定。近来，三代测序越来越凸显其长读长及快速检测病原的特点，但对于病毒整合位点的检出还比较少见，而且三代测序结果的错误率较高，目前公认的错误率为10-15％，给结果的可信性带来问题，因此对于三代测序数据的分析一般需要增加错误校正的步骤，从而提高测序结果的准确性和可信度。尽管现有许多错误校正的方法，比如根据二代和三代的测序结果对三代进行校正，或者将三代结果进行多次自校正从而降低错误率，但是由于校正软件的结果差异和用户选择能力的限制，对于其应用造成较大地限制。
技术实现思路
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本专利技术提供一种用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法。具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的第一方面，提供一种用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，其包括以下步骤：(1)从来自受试者的生物样本中提取宿主基因组DNA，并将所述宿主基因组DNA打断至主峰为800bp-4kb的片段；(2)利用探针组在步骤(1)所得到的片段中进行第一检测获得目标序列，其中，所述探针组由多个探针组成，且各探针分别包括能够与HPV基因组的特定区域选择性杂交的序列，所述目标序列包含来源于HPV基因的序列和来源于宿主基因组的序列；(3)对步骤(2)中获得的目标序列进行预处理得到预处理后的目标序列以提高检测灵敏度；和(4)基于电信号测序在不进行PCR扩增的情况下对目标序列进行第二检测，从而确认HPV在宿主基因组的整合位点。优选地，根据本专利技术的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，所述生物样本为宫颈脱落细胞或宫颈癌组织。优选地，根据本专利技术的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，所述探针组中的各探针设计为针对HPV全基因组的连续性区域。优选地，根据本专利技术的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，所述步骤(3)中的预处理包括对所述目标序列进行富集。优选地，根据本专利技术的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，所述步骤(3)中的预处理包括在所述目标序列的两端添加第一接头，然后通过与所述第一接头选择性杂交的引物进行PCR扩增。优选地，根据本专利技术的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，所述步骤(4)的第二检测包括在预处理后的目标序列的末端加A，然后依次连接条形码，接下来进行纳米孔测序。优选地，根据本专利技术的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，所述纳米孔测序的深度为5000×至10000×。本专利技术的第二方面，提供另一种用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，其包括以下步骤：(1)从来自受试者的生物样本中提取宿主基因组DNA，并将所述宿主基因组DNA打断至主峰为800bp-4kb的片段；(2)在所述片段的一端连接第三接头，利用由多个特异性引物组成的引物组和与所述第三接头选择性杂交的通用引物扩增得到目标序列，其中，所述多个特异性引物分别设计为能够与HPV基因组中的连续性序列选择性杂交，从而使所述引物组覆盖整个HPV基因组序列；和(3)基于电信号测序在不进行PCR扩增的情况下对目标序列进行检测，从而确认HPV在宿主基因组的整合位点。本专利技术的第三方面，提供另一种用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，其包括以下步骤：(1)从来自受试者的生物样本中提取宿主基因组DNA，并将所述宿主基因组DNA打断至主峰为800bp-4kb的片段；(2)在所述片段的一端连接第三接头，利用多个特异性引物组成的引物组和与所述第三接头选择性杂交的通用引物扩增得到目标序列，其中，所述多个特异性引物分别设计为能够与已知的一种HPV整合位点一侧的基因序列选择性杂交；和(3)基于电信号测序在不进行PCR扩增的情况下对目标序列进行检测，从而确认HPV在宿主基因组的整合位点。进一步地，根据本专利技术的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，所述确认HPV在宿主基因组的整合位点进一步包括数据分析步骤，其包括：对原始测序数据进行质控，除去噪音数据，得到待分析数据；使所述待分析数据与HPV基因组序列和宿主基因组序列分别进行比对，得到含有比对质量分值、比对序列位置信息的结果；按照UCSC的公式，计算比对结果的分值和一致性，分别选取HPV和宿主比对最好的结果，将两个结果组合到一起的结果输出列表；保留列表中既与HPV基因组序列又与宿主基因组序列完全比对的测序读长并比较两者的位置关系，当两种比对序列在该序列上的位置距离为间隔或者重叠10个碱基时，判断该序列即为HPV整合序列；合并相同断点序列并统计断点序列数，有5条以上序列被检出具有该相同断点时，则判断为正确的HPV整合位点。本专利技术首次采用利用探针或引物对宿主基因组的打断片段进行初步检测，然后对初步检测得到的目标序列制定了优化建库及分析策略，从而建立了一套从实验方法建立到准确地进行HPV病毒断点分析的方法，通过无需错误校正的生物信息学分析流程，可以快速准确地鉴定出HPV病毒在人基因组中的整合位点，为满足科研和临床需要提供新的策略。附图说明图1本专利技术方法中示例性验证断点的引物和序列信息。图2本专利技术方法中新的断点PCR扩增结果示意图。该图为针对本专利技术方法检出的特定整合位点设计的人与HPV病毒序列的引物PCR扩增后的DNA片段产物进行1％琼脂糖凝胶电泳的结果。其中，A-O的每个字母分别代表十三个不同的断点位置。该图说明了每对引物都成功地扩增出了本方法测序获得的整合位点序列。图3本专利技术方法中基于Sanger测序断点结果示意图。A-O的每个字母分别代表十三个不同的断点位置。结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)从来自受试者的生物样本中提取宿主基因组DNA，并将所述宿主基因组DNA打断至主峰为800bp-4kb的片段；/n(2)利用探针组在步骤(1)所得到的片段中进行第一检测获得目标序列，其中，所述探针组由多个探针组成，且各探针分别包括能够与HPV基因组的特定区域选择性杂交的序列，所述目标序列包含来源于HPV基因的序列和来源于宿主基因组的序列；/n(3)对步骤(2)中获得的目标序列进行预处理得到预处理后的目标序列以提高检测灵敏度；和/n(4)基于电信号测序在不进行PCR扩增的情况下对目标序列进行第二检测，从而确认HPV在宿主基因组的整合位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从来自受试者的生物样本中提取宿主基因组DNA，并将所述宿主基因组DNA打断至主峰为800bp-4kb的片段；
(2)利用探针组在步骤(1)所得到的片段中进行第一检测获得目标序列，其中，所述探针组由多个探针组成，且各探针分别包括能够与HPV基因组的特定区域选择性杂交的序列，所述目标序列包含来源于HPV基因的序列和来源于宿主基因组的序列；
(3)对步骤(2)中获得的目标序列进行预处理得到预处理后的目标序列以提高检测灵敏度；和
(4)基于电信号测序在不进行PCR扩增的情况下对目标序列进行第二检测，从而确认HPV在宿主基因组的整合位点。


2.根据权利要求1所述的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，其特征在于，所述生物样本为宫颈脱落细胞或宫颈癌组织。


3.根据权利要求1所述的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，其特征在于，所述探针组中的各探针设计为针对HPV全基因组的连续性区域。


4.根据权利要求1所述的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的预处理包括对所述目标序列进行富集。


5.根据权利要求1所述的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的预处理包括在所述目标序列的两端添加第一接头，然后通过利用与所述第一接头选择性杂交的引物进行PCR扩增。


6.根据权利要求1所述的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，其特征在于，所述步骤(4)的第二检测包括在预处理后的目标序列的末端加A，然后依次连接条形码和第二接头，接下来进行纳米孔测序。


7.根据权利要求6所述的用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，其特征在于，所述纳米孔测序的深度为5000×至10000×。


8.一种用于检测HPV在宿主基因组的整合位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟博，田埂，王伟伟，董如一，杨文娟，
申请(专利权)人：元码基因科技北京股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11