一种外泌体的富集方法技术

本发明专利技术涉及一种外泌体富集方法及其在生物样品中外泌体快速富集中的应用。首先对生物样品差速离心处理或超滤处理，去除样品中的细胞类干扰；向上清液中加入PEG溶液，在低温下静置一段时间；将样品放置合适温度使成均匀溶液，在低速下离心，所得沉淀即为外泌体。

An enrichment method of exosomes

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体的富集方法
本专利技术涉及一种外泌体富集方法及其在生物样品中外泌体的快速富集的应用。具体地说是一种基于低温条件下，PEG聚合物捕获外泌体，进而在低速离心条件下富集外泌体的方法。
技术介绍
在十九世纪六七十年代，研究人员在细胞外，如软骨、血和细胞培养液中，发现了许多膜包被的囊泡小体(J.CellBiol.1969,41,59-72.)。起初，人们发现其中的某些囊泡是通过细胞质膜向外出芽的方式进行释放。直到80年代，人们又发现了一种更为复杂的囊泡分泌方式。细胞内的核内体先形成多泡小体，并通过质膜融合的方式将其中包含的小囊泡释放到细胞外(J.Biol.Chem.1987,262,9412-9420)。人们详细地研究了这类囊泡的分泌形式，并首次将这一类囊泡命名为外泌体(exosomes)。后续的研究表明，包括Exosome在内，所有的外泌体都包含有蛋白质、核酸物质、脂质物质。这些物质赋予了外泌体很多功能功能，翻开了外泌体研究新的篇章(StemCells2015,33,1200-1212)。当前的外泌体富集方法中，是超速离心和密度梯度离心法是公认的金标准，但是对设备的依赖性限制了他们的广泛使用。基于高分子聚合物的沉淀富集方法因其操作简单而被广泛采用。但是该方法通常需要过夜孵育处理才能实现较高的回收效率。我们在研究中发现，合适浓度的PEG可以实现外泌体的高回收率提取。在低温环境下，将PEG加入到生物样品溶液中，通过短时间的静置后，在合适的温度下溶解，通过低速离心可以获得外泌体成分。因此，选择合适的PEG沉淀溶液，通过低温处理，可以在短时间内实现外泌体成分的富集，对于分析生物样本，尤其是大样本量的临床体液样本，具有较大意义。参考文献：1.Anderson,HC,Vesiclesassociatedwithcalcificationinthematrixofepiphysealcartilage[J].J.CellBiol.1969,41(1):59-72.2.Johnstone,RM；Adam,M；Hammond,J；Orr,L；Turbide,C,Vesicleformationduringreticulocytematuration.Associationofplasmamembraneactivitieswithreleasedvesicles(exosomes)[J].J.Biol.Chem.1987,262(19):9412-9420.3.Vaidyanathan,R；Naghibosadat,M；Rauf,S；Korbie,D；Carrascosa,LG；Shiddiky,MJ；Trau,M,Detectingexosomesspecifically:amultiplexeddevicebasedonalternatingcurrentelectrohydrodynamicinducednanoshearing[J].Anal.Chem.2014,86(22):11125-11132.
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种外泌体富集方法，可以实现生物样品中外泌体的快速富集。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：取1μL-100mL生物样品，例如细胞培养液，菌株培养液，组织培养液，及各种体液样本及临床检测用液体检材，如血液、尿液，唾液，精液，胆汁，脑脊液，呼吸道清洗液，等等。进行预处理，首先在200g-500g条件下离心3-15分钟，然后吸取上清液，在2000g-5000g条件下离心10-30分钟，最后在10000g-20000g条件下离心0.5-3h。最后一步离心操作可以改为经过0.1-0.3微米的滤膜进行过滤。使用pH值为6-8的水、细胞培养用PBS缓冲液或磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液配置分子量为2000-50000Da的PEG母液，配制的质量浓度为30-80％的PEG溶液作为母液加入到生物样品中，使终浓度达到2-10％。向生物样品中加入DMSO，丙酮，丁醇中的一种或几种有机溶剂，使其终浓度范围为0-80％。向生物样品中加如盐溶液，可以为氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钠等的一种或几种，使其终浓度范围为0-300mM。将加入各种添加物的混合液混匀后，放置于-200℃至+10℃环境中，静置1min-60min。然后将样品置于0℃-37℃进行温度平衡，至样品呈均匀溶液。将样品在500g-5000g条件下进行离心5min-30min，得到沉淀为外泌体。将外泌体，溶解在PBS中，再进行一次沉淀操作，获得进一步纯化的外泌体。所得的外泌体可用于临床生物化学检测、基因组学、代谢组学、蛋白质组学分析及活性研究。本专利技术的优点为：低温处理可以明显减少处理时间，适用于生物样品中外泌体的快速处理。附图说明图1多次重复试验显示处理方法具有较高的重现性；结果显示：6次处理方法得到的蛋白质组学结果具有较好的重现性。图2富集外泌体蛋白质组学结果用于疾病的分型分析；结果显示：通过对富集得到外泌体进行分析，可以对32例病人样本进行初步疾病分型分析。具体实施方式实施例1将10mL人尿液置于200g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在2000g条件下离心20分钟，经过0.22微米的滤膜过滤。向滤过液中加入质量浓度为50％的PEG10000的PBS溶液，使PEG终质量浓度为8％，加入氯化钠使终浓度为150mM，加入DMSO使终体积浓度为5％，将样品置于-20℃，静置时间30min后，将样品置于4℃进行融化。将融化后的样品在500g条件下进行离心，时间30min。离心后所得沉淀为外泌体样品。NTA分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示样品该处理流程得到的技术重现性较高(附图1)。实施例2将10mLHELA细胞培养液置于500g条件下离心5分钟，将上清液置于4000g条件下离心20分钟，经过0.22微米的滤膜过滤。向滤过液中加入质量浓度为50％的PEG水溶液使PEG20000终质量浓度为8％，加入DMSO使终体积浓度为10％，将样品置于-80℃，静置时间10min后，将样品置于37℃进行融化。将融化后的样品在5000g条件下进行离心，时间5min。离心后所得沉淀为外泌体样品。NTA分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示具有较多外泌体蛋白质。实施例3将0.2mL人血浆，用PBS稀释至10mL，500g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在2000g条件下离心20分钟，10000g条件下离心1h。向滤过液中加入质量浓度为50％的PEG2000的PBS溶液使PEG终质量浓度为12％，加入氯化钠使终浓度为50mM，加入丁醇使终体积浓度为5％，将样品置于-60℃，静置时间20min后，将样品置于37℃进行融化。将融化后的样品在4000g条件下进行离心，时间20min。离心后所得沉淀为外泌体样品。NTA分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示多数蛋白归属于Exocart数据库。实施例4将0.2mL人血浆，用PBS稀释至10mL，1000g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在4000g条件下离心20分钟，上清20000g条件下离心2h。向滤过液中加入质量浓度为50％的PEG20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外泌体的富集方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将生物样品进行预处理；2)向步骤1)所得的生物样品中加入PEG溶液，以及加入或不加入有机试剂和/或盐溶液；3)将步骤2)所得的溶液混合均匀，放置低温环境下静置冻结，然后将样品放置一定温度下融化使成均匀溶液；4)将步骤3)所得的溶液将样品于低速下离心，所得沉淀即为外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种外泌体的富集方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将生物样品进行预处理；2)向步骤1)所得的生物样品中加入PEG溶液，以及加入或不加入有机试剂和/或盐溶液；3)将步骤2)所得的溶液混合均匀，放置低温环境下静置冻结，然后将样品放置一定温度下融化使成均匀溶液；4)将步骤3)所得的溶液将样品于低速下离心，所得沉淀即为外泌体。2.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：生物样品为细胞培养液，菌株培养液，组织培养液，及其各种体液样本及临床检测用液体检材，如血液、尿液、唾液、精液、胆汁、脑脊液、呼吸道清洗液中的一种或二种以上。3.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：生物样品的体积为1μL-100mL。4.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：生物样品进行预处理方法为：首先在200g-500g条件下离心3-15分钟，然后吸取上清液A；上清液A在2000g-5000g条件下离心10-30分钟，然后吸取上清液B；最后上清液B在10000g-20000g条件下离心0.5-3h或经过0.1-0.3微米的滤膜进行过滤，得所需要液体。5.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：所使用的PEG(聚乙二醇)，分子量为2000-50000Da，使其于体系中加入的终质量浓度为2-10％。6.按照权利要求1或5所述的富集方法，其特征在于：配制的质量浓度为30-80％的PEG溶液作为母液加入到生物样品中，所选溶液体系可以为下列溶剂中的一种，纯水，细胞培养常...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，随志刚，杨开广，侯瑞，袁辉明，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21