包含二肽的培养基制造技术

本发明专利技术涉及培养基，优选细胞培养基，其包含至少一种二肽，所述二肽包含天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)。本发明专利技术还涉及本发明专利技术所述的培养基用于培养细胞，优选植物细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的用途。本发明专利技术的另一方面涉及制备细胞培养产物的方法，包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与根据本发明专利技术所述的培养基接触；和(iii)从所述培养基或所述细胞中获得所述细胞培养产物。

Media containing Dipeptides

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含二肽的培养基专利
本专利技术涉及生物技术生产方法。更具体地，本专利技术涉及用于生物技术生产方法的改进的培养基、使用这种改进的培养基的方法以及使用改进的培养基从该方法获得的产物。专利技术背景生物技术方法广泛用于生物产物的生产。这些方法通常涉及在培养细胞生长和产物形成所允许的条件下在培养基中培养细胞。在生物技术生产中有用的细胞是细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞和动物或植物来源的细胞。长期以来，动物细胞培养物已被用于生产生物产物，例如治疗性蛋白质、多肽、寡肽或其他生物分子，例如治疗性多糖。在这种细胞培养方法中，通常经遗传修饰以产生所需产物的动物细胞在液体、固体或半固体培养基中培养用于细胞增殖和产物形成。细胞培养的一个显著优点是这样的事实：动物细胞和植物细胞能够进行初级产物的翻译后修饰，例如多肽的折叠和翻译后修饰。在生物技术生产过程中、特别是在动物细胞培养中，细胞培养条件的控制和优化对于细胞增殖和产物形成是至关重要的。一个决定性因素是培养基组成。最终细胞培养产物的浓度和质量在很大程度上取决于培养基组成。动物和植物细胞培养在所需的营养组成和培养条件方面是特别苛刻的。所需的营养物质不仅包括基本的碳源、氮源和能源(如糖和氨)，而且可能需要更复杂的营养物质(例如必需氨基酸和维生素)。为此，已经使用具有复杂营养组成(例如血清)的动物细胞培养基的补充来为动物细胞提供多种营养物质。然而，监管和安全问题以及可用的血清来源的异质性问题导致该行业努力从工业细胞培养工艺中消除血清和其他非成分确定的培养基。然而，在无血清培养基中生长的细胞培养物通常显示出营养不良。为此，已经进行了很多努力来鉴定复杂培养基的那些营养成分，以及它们的最佳浓度，这是细胞培养物中令人满意的生长和蛋白质形成所需的。已知用氨基酸供应细胞培养物对生长速率和产量具有显著影响。谷氨酰胺常规用于细胞培养基，因为它是培养细胞的重要的碳源、氮源和能源。已经证明，动物细胞培养物的最佳生长所需的谷氨酰胺的量是其他氨基酸量的3至10倍(Eagle等人，Science130：432-37)。然而，谷氨酰胺作为营养物质在高温(例如加热灭菌条件)下溶解于水时是不稳定的，因为在加热时形成了焦热谷氨酸和氨(Roth等人，1988，InVitroCellular&DevelopmentalBiology24(7)：696-98)。为此，谷氨酸而不是谷氨酰胺通常用于细胞培养基(CellCultureTechnologyforPharmaceuticalandCell-basedTherapies，52，Sadettin等人，Eds.，TaylorandFrancisGroup，2006)。其他研究小组试图通过向细胞培养基中加入含谷氨酰胺的二肽(如丙氨酰谷氨酰胺或甘氨酰谷氨酰胺)来避免形成不需要的物质，如焦谷氨酸和氨(Roth等人(1988)，InVitroCellular&DevelopmentalBiology24(7)：696-98)。然而其他研究小组已提出酰化二肽以使其在加热灭菌条件下更稳定。US5,534,538描述了N-酰基二肽及其在加热灭菌的肠内或肠胃外营养产物。Franek等人(2002，Biotechnol.Prog.18，155-158；US2004/0072341)筛选了各种合成寡肽(包括寡聚-Gly、寡聚-Ala)对无血清培养基中小鼠细胞系的影响。他们报道，虽然单个氨基酸和测试的二肽没有显著改变培养性能，但三-、四-和五-甘氨酸以及三-和四-丙氨酸增强了活细胞密度和细胞活力。WO2011/133902公开了包含二肽的细胞培养基，其中二肽包括在水中具有低溶解度的氨基酸，在这种情况下为酪氨酸和半胱氨酸。半胱氨酸不仅在水中具有低溶解度，而且由于存在反应性巯基，它也是不稳定的。作者已经发现，通过在二肽中掺入酪氨酸和半胱氨酸，可以改善氨基酸的溶解度和稳定性问题。作者还发现了所得细胞培养基的保存期限得到改善。在一个实施方案中，二肽的剩余氨基酸(不是半胱氨酸或酪氨酸)是天冬酰胺。WO2012/019160公开了动物细胞培养物，其中在生产阶段期间，无血清培养基补充有含Tyr和His的二肽。描述了添加含Tyr和His的二肽对生长和产物形成的积极效果。EP0220379和DE3538310公开了含有谷氨酰胺的二肽和三肽在细胞培养基中的用途。谷氨酰胺以二肽的形式加入，以避免由高温下谷氨酰胺的不稳定性引起的问题。含谷氨酰胺的二肽用作温度不敏感的谷氨酰胺来源。JP61271985公开了一种可用于动物细胞的培养基，其包含二肽Xxx-L-谷氨酰胺，其中Xxx是甘氨酸、D/L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、L-赖氨酸或L-苯丙氨酸。虽然上述现有技术中描述的细胞培养基为某些细胞培养工艺提供了令人满意的性能和性质，但现有技术的培养基仍然不是最佳的。仍然需要进一步改进的培养基，其促进生物技术生产工艺中的更好的生长和产物形成。专利技术概述本专利技术解决了已知培养基的上述缺点。本专利技术由所附独立权利要求的术语限定。本专利技术的优选实施方案由从属权利要求限定。因此，本专利技术涉及培养基，优选细胞培养基，其包含至少一种二肽，所述二肽包含天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)。本专利技术还涉及本专利技术的培养基用于培养细胞，优选植物细胞，动物细胞或哺乳动物细胞的用途。本专利技术的另一方面涉及制备细胞培养产物的方法，包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与根据本专利技术的培养基接触；和(iii)从所述培养基或所述细胞中获得所述细胞培养产物。在本专利技术的以下详细描述中更详细地描述了本专利技术的优选实施方案。附图简要说明图1描述了使用具有不同量的本专利技术的二肽的细胞培养基的各种培养物中随时间的活细胞密度。图2描述了使用具有不同量的本专利技术的二肽的细胞培养基的各种细胞培养物中随时间的细胞活力。图3描绘了使用具有不同量的根据本专利技术的二肽的细胞培养基从细胞培养物获得的相对产物浓度。专利技术详述根据本专利技术，“培养基”应理解为含有营养物质的液体或固体培养基，该培养基适于滋养和支持培养物中细胞的生命和/或产物形成。根据本专利技术，培养的细胞可以是细菌细胞，酵母细胞，真菌细胞，动物细胞，如哺乳动物细胞或昆虫细胞，和/或植物细胞，如藻类。通常，培养基提供必需和非必需氨基酸、维生素、至少一种能源、脂质和微量元素，所有这些都是细胞维持生命、生长和/或产物形成所需的。培养基还可含有增加生长和/或存活率(以高于最小比率)的组分，包括激素和生长因子。培养基优选具有一定pH和盐浓度，其支持细胞的生命、生长和/或产物形成。根据本专利技术的培养基优选包含维持细胞培养物的生命和增殖所必需的所有营养物。优选的培养基是确定的培养基。根据本专利技术，“成分确定的培养基”是不含细胞提取物、细胞水解产物或蛋白质水解产物的培养基。优选的成分确定的培养基不包含未知组成的组分。如本领域技术人员通常理解的，成分确定的培养基通常不含动物来源的组分。优选地，成分确定的培养基的所有组分具有已知的化学结构。优选的成分确定的培养基是无血清培养基。其他优选的成分确定的培养基是合成培养基。除了成分确定的培养基之外的培养基被称为“复杂”培养基。“细胞培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养基，例如细胞培养基，其包含至少一种二肽，所述二肽包含天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.09 DE 102017203908.61.一种培养基，例如细胞培养基，其包含至少一种二肽，所述二肽包含天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)。2.根据权利要求1所述的培养基，其中所述二肽是Asn-Gln或Gln-Asn，优选Gln-Asn。3.根据前述权利要求中任一项所述的培养基，其中所述二肽以0.1至10mM的浓度存在于所述培养基中。4.根据前述权利要求中任一项所述的培养基，所述培养基还包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和/或至少一种维生素。5.根据前述权利要求中任一项所述的培养基，其中所述培养基不含生长因子。6.根据前述权利要求中任一项所述的培养基，其中所述培养基为液体形式，凝胶、粉末、颗粒、小丸形式，或片剂形式。7.根据前述权利要求中任一项所述的培养基，其中所述细胞培养基是无血清培养基或成分确定的培养基。8.根据前述权利要求中任一项所述的培养基，其中相对于所...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·梅茨，A·卡劳，T·赫尔曼，G·纳奥普，
申请(专利权)人：赢创德固赛有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE