一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用，所述标志物为SEQ ID No:1所示的ETV5。本发明专利技术提供的mRNA标志物ETV5对于诊断UC具有很高的特异性及灵敏度，可以作为新型的生物标志物用于UC的临床诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用
本专利技术属于医学分子生物学
，具体涉及一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用。
技术介绍
溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)是一种主要累及结肠的慢性、非特异性的炎症性疾病，临床表现主要包括腹痛、腹泻及粘液脓血便等。虽然目前UC的发病机制仍不清楚，但是越来越多的研究表明，CD4+T细胞免疫调节功能紊乱诱导的炎症反应在UC发生发展过程中发挥关键作用。随着环境和饮食习惯改变，UC发病率在我国呈逐年上升趋势。该病易复发，常迁延不愈，有致残、癌变等风险，给患者身心造成沉重打击。随着科技进步，UC的诊断和治疗不断发展。目前用于UC临床诊断的的方法主要为内镜、组织病理学和血液检查。但是许多患者因病情严重导致肠腔狭窄、虚弱等情况，难以耐受内镜检查，使得临床诊断和病情严重程度评估受到巨大限制。血液检查包括血沉、C-反应蛋白、内毒素等指标，但是由于上述指标缺乏特异性，导致UC难以与其他消化道疾病(如：淋巴瘤、肠结核、缺血性肠炎等)相鉴别，易引起误诊，延误治疗。此外，由于发病机制尚不明确，目前UC的临床治疗亦面临巨大挑战。因此，探索UC的发病机制，寻找特异性的UC诊断标志物和治疗靶点，对我国UC的临床诊治极其重要。人类ETSvariant5(ETV5)基因位于3号染色体上。有研究表明，ETV5在多种肿瘤性疾病及自身免疫性疾病的发生发展过程中发挥重要作用。但是ETV5基因在UC患者外周血CD4+T细胞中的表达水平及其对CD4+T细胞的免疫调节作用未见相关报道。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用，该mRNA标志物为ETV5，该mRNA标志物对于诊断UC具有很高的特异性及灵敏度，可以作为新型的生物标志物用于UC的临床诊断。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物，所述标志物为SEQIDNo:1所示的ETV5。针对上述mRNA标志物的引物组合，包括如SEQIDNo:2所示的上游引物和如SEQIDNo:3所示的下游引物。上述mRNA标志物在制备诊断溃疡性结肠炎的产品中的应用。上述引物组合在制备诊断溃疡性结肠炎的产品中的应用。一种溃疡性结肠炎检测试剂盒，包括权利要求2所述的引物组合。进一步地，上述检测试剂盒还包括mRNA逆转录试剂和mRNAqRT-PCR反应试剂。有益效果：1、采用qRT-PCR技术检测UC患者和健康对照者外周血CD4+T细胞中ETV5mRNA表达水，为UC的临床诊治提供新的生物标志物和治疗靶点。2、ETV5作为生物标志物用于UC诊断的敏感性高，特异性强，操作简单，结果稳定，具有广泛的临床应用前景。ETV5作为诊断标志物的特异度和灵敏度都达到90％以上，是诊断UC的比较可靠的特异性标志物。附图说明图1为实施例1中UC患者和健康对照者的ETV5表达差异分析；图2为实施例1中ETV5表达水平对UC诊断的ROC曲线分析。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。实施例11.化合物：ETV5qRT-PCR引物和GAPDHqRT-PCR引物。ETV5上游引物ACGACACTTGTGTTGTGCCTGAG(SEQIDNo:2)ETV5下游引物GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG(SEQIDNo:3)GAPDH上游引物GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT(SEQIDNo:4)GAPDH下游引物CTTGAACTCCATGCCTCGACCTG(SEQIDNo:5)2.组合物：(1)mRNA逆转录试剂：5×PrimerScriptRTMasterMix，RNase-freeH2O。(Takara生物公司提供)。(2)mRNAqRT-PCR反应试剂：TBGreenPremixExTaq(TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+，TliRNaseH，TBGreen)；ROXReferenceDyeII；ETV5qRT-PCR上游引物和下游引物。该方法以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以很好地抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。(Takara生物公司提供)。3.方法：(1)分离提取外周血CD4+T细胞：使用肝素抗凝试管收集UC患者和健康对照者外周静脉血10mL。将收集的外周血与等体积的磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline，PBS)混匀，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，室温下2000rpm梯度离心20分钟。离心结束后用吸管缓慢吸取中间云雾层细胞置于50mL离心管中，用PBS清洗，1800rpm离心8分钟后弃上清可得到单个核细胞。将上述单个核细胞转移至流式管中，加入200微升CD4+T细胞分选磁珠(购自BDBiosciences)，冰上孵育30分钟。孵育结束后将试管置于磁柱上提取CD4+T细胞，重复该步骤三次纯化CD4+T细胞并转移至无菌无酶EP管中，即为所需外周血CD4+T细胞样本。加入1mLTrizol室温放置5分钟后保存于-80℃冰箱中备用。(2)RNA提取：将预先准备好的UC患者和健康对照者CD4+T细胞标本置于室温溶解，加入200微升氯仿，充分混匀并剧烈震荡15s后置于室温下5min。将上述标本在4℃、12000rpm条件下离心15min。离心结束后缓慢吸取上层清液400微升至另一EP管中，然后加入500微升异丙醇。缓慢混匀后室温静置10分钟，然后在4℃、12000rpm离心条件下离心10min可见RNA沉于EP管底部。弃去全部液体，加入75％乙醇静置5分钟在4℃，7500rpm条件下离心5min。离心结束后吸弃乙醇，置于室温下迅速烘干，可得到纯化后的RNA。加入适量DEPC水溶解RNA，使用ExperionAutomatedElectrophoresisSystem(美国Bio-RadLaboratories)检测RNA纯度及浓度，A260/280介于1.8-2.0的RNA样本可用于后续PCR实验。(3)mRNA逆转录：使用Takara公司mRNA逆转录试剂盒对ETV5mRNA进行逆转录获得模板cDNA，该试剂盒包含了：5×PrimerScriptRTMasterMix，RNase-freeH2O。具体方法及步骤如下：将上述试剂取出后分别放置在冰上进行缓慢融解，待溶解完全后混匀，按照如下表格所示体积配制所需的反应溶液。试剂组分体积RNA(400ng/μL)1μL5×PrimerScriptRTMasterMix2μLRNase-freeH2O7μL以上溶液混匀后，置于逆转录PCR仪中，使用逆转录反应程序为：37℃15分钟，85℃5秒。逆转录反应结束后，将所得cDNA样本迅速转移至冰上冷却，用于以下qRT-PCR实验。(4)qRT-PCR实验ETV5qRT-PCR检测使用Takara公司mRNA检测剂盒，ETV5前引物、后引物，内参基因GAPDH前引物、后引物。qRT-PCR反应过程中ETV5和GAPDHcDNA扩增信号及CT值使用ABI公司的7500型实时PCR仪进行收集。具体过程如下：将上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物，其特征在于：所述标志物为SEQ ID No:1所示的ETV5。

【技术特征摘要】
1.一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物，其特征在于：所述标志物为SEQIDNo:1所示的ETV5。2.权利要求1所述mRNA标志物的引物组合，其特征在于：包括如SEQIDNo:2所示的上游引物和如SEQIDNo:3所示的下游引物。3.权利要求1所述的mRNA标志物在制备诊断溃...

【专利技术属性】
技术研发人员：石岩，许亚平，姚俊，
申请(专利权)人：镇江市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32