一种用于检测SFTPB基因突变的引物组、试剂盒及其扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测SFTPB基因突变的引物组、试剂盒以及扩增方法，该引物组包括PCR扩增引物组和测序引物组；该试剂盒包括所述引物组，该试剂盒还包括PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂；该扩增方法包括两个阶段：(1)第一阶段反应：95℃预变性2min；94℃变性20s，起始温度为64℃退火40s，每个循环递减0.5℃，72℃延伸1min，完成11个循环；(2)第二阶段反应：94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸1min，完成24个循环；72℃延伸2min；本发明专利技术可以特异性地鉴别SFTPB基因是否突变，确保测定结果的准确性和唯一性；可以用于慢阻肺的疾病诊断，同时还可以用于研究SFTPB SNP位点与基因功能之间关系；能大幅度提高PCR的特异性和效率，从扩增到测序过程简单易操作，耗时少。

A primer set, kit and amplification method for detecting sftpb gene mutation

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测SFTPB基因突变的引物组、试剂盒及其扩增方法
本专利技术属于生物技术和医学研究应用领域，主要内容为检测慢阻肺发生发展相关基因SFTPB基因突变，具体涉及用于检测SFTPB基因突变的引物组，包括扩增引物组和测序引物组，还涉及两种引物组在PCR扩增获得核酸样品中发挥的用途，PCR扩增反应体系和条件，以及包含该引物组的试剂盒，特别涉及一种用于检测SFTPB基因突变的引物组、试剂盒及其扩增方法。
技术介绍
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是一种持续存在的、以呼吸道症状和气流受限为特征的、可防治的常见呼吸道疾病，通常由有害颗粒或气体暴露所引起的气道和(或)肺泡异常导致。早期主要表现为慢性咳嗽、咳痰、气短、胸闷或呼吸困难，随疾病进展，患者逐渐出现食欲减退、外周肌肉萎缩、焦虑抑郁等并发症。2015年，全球疾病负担研究(GlobalBurdenofDiseases,Injuries,andRiskFactors，GBD)显示，全球慢阻肺人数已达174500万，死亡人数为320万，其患病率仅达哮喘1/2，死亡率却是哮喘8倍以上，预计截至到2030年，慢阻肺会成为世界第三常见死亡病因。我国最新的一项流行病学调查研究显示，我国20岁以上成人慢阻肺患病人数为9990万，约1亿，患病率已达到8.6％。虽然慢阻肺的气流受限呈进行性发展，不可逆转，但慢阻肺是可以预防、控制的，提高对慢阻肺危险因素的认识，采取有效的防控措施，有可能降低其发病率、死亡率，减少并发症的发生。已有大量文献报道，吸烟是慢阻肺重要的环境危险因素，几乎90％慢阻肺患者是吸烟人群，但是仅有10％-15％的小部分吸烟人群才会发展为临床症状显著的慢阻肺。即使是重度吸烟者，慢阻肺的发病率还不到50％。因此，吸烟引起的慢阻肺易感性存在个体差异。另有研究发现，有慢阻肺家族史的人群，患慢阻肺的风险性是无慢阻肺家族史人群的2.08倍，且家族中患有慢阻肺的人数越多，其他成员患慢阻肺的风险性就越大，表明遗传因素在慢阻肺的易感性中具有重要作用。尽管大量研究已经开展并证明了遗传因素的重要性，但是也尚未能明确确定导致慢阻肺发生发展的遗传因素。目前，α1抗胰蛋白酶的基因SERPINA1突变是唯一已确定的与慢阻肺相关的遗传风险因素，但是该基因上的致病突变在非洲和亚洲群体中小于0.004％，只能解释约2％的慢阻肺患者。近年来，基因组关联分析被广泛应用和开展，陆续发现了许多与慢阻肺发生相关的易感基因。SFTPB(surfactantproteinB，肺表面活性蛋白B)是一种疏水性的小分子肺表面活性蛋白，是肺泡表面活性物质中的重要成分，分布于肺泡、气管和各级支气管中，具有降低肺泡表面张力、促进气道液体清除、维持肺泡和气道稳定性的作用。SFTPB基因位于人类2号染色体短臂上，其等位基因具有多态性，突变概率为百万分之三。位于SFTPB基因启动子Promoter、5'UTR(5侧翼非翻译区)、3'UTR(3侧翼非翻译区)、内含子和编码区域的多个单核苷酸多态性位点，被认为是潜在影响SFTPB功能的位点。但是，主要突变分布在前9个外显子上，其中发生在第2、4、7外显子上的突变尤为明显。我们前期研究采集434例慢阻肺患者和335例健康对照患者的血液样本，通过病例对照研究，采用SNP分型技术检测SFTPB基因rs1130866和rs2118177位点多态性，发现rs1130866位点与慢阻肺的发生相关，且T等位基因是慢阻肺的保护因素，而rs1130866位点位于SFTPB基因的第4外显子上。关于墨西哥和德国人群的研究也发现SFTPB基因多态性与慢阻肺易感性相关。
技术实现思路
本专利技术采用聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)技术扩增SFTPB基因启动子Promoter和5'UTR区域片段、全部外显子区、3'UTR，一代测序法(Sanger法)对PCR产物进行测序，检测SFTPB基因的各个位置任何一个碱基是否突变。这种方法可实现对少量样本进行SFTPB基因突变位点检测，包括已知的相关突变位点，也会发现未知突变或低频率突变位点和个性化的突变位点，有助于查清病因，识别家系中高风险的成员。对患者进行SFTPB基因全面检测，特别是针对早期无症状的慢阻肺疾病患者的检测，对临床上指导用药，寻找病因，基因评估等具有重要的意义。本专利技术对于一些临床小样本的SFTPB基因突变检测具有很高的实用价值。本专利技术采用的技术方法应用过其他疾病基因的突变检测。但是，本专利技术目的是检测慢阻肺相关基因SFTPB的突变。在实施过程中，涉及的序列信息、反应体系成分、温度、时间等具体的参数是不同于其他疾病基因的突变检测。聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)技术和一代测序法(Sanger法)结合已经用于多种疾病基因突变检测，但是未应用于慢阻肺基因突变检测。基于前期研究结果发现，SFTPB基因多态性与慢阻肺发生发展相关。因此，本专利技术针对SFTPB基因设计PCR扩增反应和测序反应，旨在检测SFTPB基因突变情况。本专利技术采用聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)技术扩增SFTPB基因启动子Promoter和5'UTR、第1到第13号外显子区、3'UTR区域片段，一代测序法(Sanger法)对PCR产物进行测序，检测SFTPB基因的各个位置任何一个碱基是否突变。这种方法可实现对少量样本进行SFTPB基因突变位点检测，包括已知的相关突变位点，也会发现未知突变或低频率突变位点和个性化的突变位点，有助于查清病因，识别家系中高风险的成员。对患者进行SFTPB基因全面检测，特别是针对早期无症状的慢阻肺患者的检测，对临床上指导用药，寻找病因，基因评估等具有重要的意义。本专利技术对于一些临床小样本的SFTPB基因突变检测具有很高的实用价值。专利技术的目的在于提供一种用于检测SFTPB基因突变的引物组、试剂盒及其扩增方法，解决了如何准确检测慢性阻塞性肺疾病的问题。本专利技术目的之一是提供一种用于检测SFTPB基因突变的引物组，包括PCR扩增引物组和测序引物组。SFTPB基因启动子Promoter和5'UTR、第1到第13号外显子区、3'UTR的任一区域在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，都视为SFTPB基因发生了突变。因此，根据SFTPB基因启动子Promoter和5'UTR、第1到第13号外显子区、3'UTR，共设计出17对特异性扩增SFTPB基因Promoter和5'UTR、第1到第13号外显子区、3'UTR片段的引物组，其中启动子Promoter区域片段包含5'UTR。然后，经过测序引物组测序鉴定SFTPB基因是否发生突变。本专利技术提供一种用于检测SFTPB基因突变的引物组，包括SFTPB基因启动子Promoter和5'UTR、第1到第13号外显子区、3'UTR对应的PCR扩增引物组。所述引物组分别为SFTPB基因的启动子Promoter和5'UTR的PCR扩增引物，第1外显子区(Exon1)的PCR扩增引物、第2外显子区(Exon2)的PCR扩增引物、第3外显子区(Exon3)的PCR扩增引物、第4外显子区(Exon4)的PCR扩增引物、第5外显子区(Exon5)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测SFTPB基因突变的引物组，其特征在于：该引物组包括PCR扩增引物组和测序引物组。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测SFTPB基因突变的引物组，其特征在于：该引物组包括PCR扩增引物组和测序引物组。2.一种用于检测SFTPB基因突变的引物组，其特征在于：所述PCR扩增引物组包括SFTPB基因启动子Promoter和5'UTR、第1到第13号外显子区、3'UTR对应的PCR扩增引物组。3.根据权利要求2所述的一种用于检测SFTPB基因突变的引物组，其特征在于：所述的SFTPB基因启动子Promoter和5'UTR的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的引物FP1与核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的引物RP1；所述的SFTPB基因第1号外显子Exon1的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的引物FP2与核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的引物RP2；所述的SFTPB基因第2号外显子Exon2的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的引物FP3与核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的引物RP3；所述的SFTPB基因第3号外显子Exon3的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的引物FP4与核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的引物RP4；所述的SFTPB基因第4号外显子Exon4的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的引物FP5与核苷酸序列如SEQIDNO.10所示的引物RP5；所述的SFTPB基因第5号外显子Exon5的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQIDNO.11所示的引物FP6与核苷酸序列如SEQIDNO.12所示的引物RP6；所述的SFTPB基因第6号外显子Exon6的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQIDNO.13所示的引物FP7与核苷酸序列如SEQIDNO.14所示的引物RP7；所述的SFTPB基因第7号外显子Exon7的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQIDNO.15所示的引物FP8与核苷酸序列如SEQIDNO.16所示的引物RP8；所述的SFTPB基因第8和第9号外显子Exon8和Exon9的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQIDNO.17所示的引物FP9与核苷酸序列如SEQIDNO.18所示的引物RP9；所述的SFTPB基因第10号外显子Exon10的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQIDNO.19所示的引物FP10与核苷酸序列如SEQIDNO.20所示的引物RP10；所述的SFTPB基因第11号外显子Exon11和部分的3'UTRPCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQIDNO.21所...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙德俊，徐桂华，王潇，高笑宇，李媛，
申请(专利权)人：内蒙古自治区人民医院，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15