一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码RNA及其引物和试剂盒制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码RNA及其引物和试剂盒，所述长链非编码RNA为ENST00000542697。本发明专利技术基于微滴式数字PCR技术鉴定多环芳烃暴露人群血浆样本中特定的一种LncRNA表达量的差异变化，及早准确评估多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的风险，公开检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的生物标记物LncRNA的试剂盒，试剂盒中包含的LncRNA的引物探针和相关试剂。本发明专利技术提供的分子标记可以快速检测出与多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的风险的LncRNA，结果准确可靠，及早发现人群在多环芳烃暴露的情况下氧化应激严重程度，及时采取相关措施提供科学依据。

A long-chain noncoding RNA and its primers and kits for detecting oxidative stress injury in people exposed to polycyclic aromatic hydrocarbons

【技术实现步骤摘要】
一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码RNA及其引物和试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码RNA及其引物和试剂盒。
技术介绍
多环芳烃是煤，石油，木材，烟草，有机高分子化合物等有机物不完全燃烧时产生的挥发性碳氢化合物，是重要的环境和食品污染物，广泛分布于环境中，与日常工作和生活息息相关。除了我们所熟知的致癌、致突变以及致心血管损伤外，长期接触多环芳烃可使体内氧化应激水平增加。8-羟基脱氧鸟苷是一种重要的DNA氧化损伤的生物标志物，8-异前列腺素-F2α则是脂质过氧化的可靠生物标志物结合，这两者可用来代表人体的氧化应激水平。长期接触多环芳烃的暴露人群会出现8-羟基脱氧鸟苷和8-异前列腺素-F2α的增高，因此对氧化应激损害进行快速、准确的诊断具有重要的临床意义。LncRNA是基因转录组的重要组成部分，其长度大于200个核苷酸，且不具有蛋白质编码功能。LncRNA广泛表达于免疫细胞中，参与免疫细胞分化与活化，通过激活或抑制转录因子，调节信使核糖核酸和微小RNA(microRNA)的稳定性，从而参与多种疾病发生。LncRNA通常会形成较为稳定的二级结构，为在血浆中检测LncRNA提供了可能性，通过检测外周血循环系统中异常表达的LncRNA有望成为某些疾病的早期诊断依据，具有潜在的临床价值。综上所述，目前有必要探寻新的有效的非编码RNA作为多环芳烃暴露人群氧化应激损伤检测的标记物，为诊断多环芳烃暴露人群氧化应激损伤提供依据。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码RNA及其引物和试剂盒，可以快速检测出与多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的风险的相关LncRNA，结果准确可靠。本专利技术提供的技术方案：一种基于微滴式数字PCR定量检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码RNA，所述长链非编码RNA为ENST00000542697，所述ENST00000542697的核酸序列如SEQIDNO:1所示。一种长链非编码RNA在检测多环芳烃暴露人群氧化应激期损伤的分子标志物中的用途。一种引物，用于检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的ENST00000542697的长链非编码RNA表达水平，ENST00000542697的上游引物核苷酸序列为：5'-AAATGGGCTAACACTGAAAGAACC-3'，下游引物核苷酸序列为：5'-CCTGCCGAGGCTTGGATTAC-3'。一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，包含上述的引物。一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，所述试剂盒还包括内参基因β-actine的引物和探针序列、ENST00000542697的探针序列；内参基因β-actine的上游引物序列：5’-CATCCTCACCCTGAAGTA-3’，内参基因β-actine的下游引物序列：5’-AGGTCTCAAACATGATCTG-3’，内参基因β-actine的探针序列：5’-ACGGCATCGTCACCAACTGG-3’，HEX荧光基团，BHQ淬灭基团；ENST00000542697的探针序列：5'-TGCAGAATCTCAGCAACGTCACAGAGG-3'，FAM荧光基团，BHQ淬灭基团。所述检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，还包括反转录所需试剂：反转录缓冲液、dNTP混合液、RNA酶蛋白质抑制剂、反转录酶和无核酸酶纯水。所述的检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，其特征在于还包括微滴式数字PCR所需的下列试剂：微滴式数字PCR预混液，无核酸酶纯水，微滴分析专用油，微滴发生专用油。一种基于微滴式数字PCR定量检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的非编码RNA分子标志物的方法，所述检测方法包括以下步骤：(1)收集多环芳烃暴露人群及对照人群的静脉血，分离血浆，进行芯片扫描；(2)以步骤(1)中血浆进行提取总RNA，以总RNA为扩增模板逆转成cDNA，采用所述检测试剂盒中的引物，然后基于微滴式数字PCR扩增LncRNAENST00000542697与β-actine；(3)读取和分析步骤(2)中微滴式数字PCR反应扩增结果，得到LncRNAENST00000542697与β-actine的拷贝数，得到非编码RNA分子标志物的表达水平。所述的基于微滴式数字PCR定量检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的非编码RNA分子标志物的方法，所述步骤(2)中血浆总RNA采用血浆miRNA提取试剂盒进行提取。(Qiagen公司的血浆miRNA提取试剂盒)。所述的基于微滴式数字PCR定量检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的非编码RNA分子标志物的方法，步骤(2)中逆转录的反应体系如下：总RNA12ul，5x缓冲液4ul，RNA酶抑制剂(20U/uL)1ul，10mMdNTP2ul，逆转录酶(200U/uL)1ul，共20ul体系，混匀后，逆转录反应程序如下：25℃，5min；42℃，6min；70℃，5min；步骤(2)中微滴式数字PCR的反应体系如下：2×PCR预混液10μL、LncRNAENST00000542697上游引物浓度20μmol/μL1μL、LncRNAENST00000542697下游引物浓度20μmol/μL1μL、LncRNAENST00000542697探针20μmol/μL0.5μL(FAM)，β-actine上游引物20μmol/μL1μL，β-actine下游引物浓度20μmol/μL1μL、β-actine探针20μmol/μL0.5μL(HEX)，扩增模板3μL，补水至20μL，微滴式数字PCR的反应程序如下：A)预变性：95℃，10min；B)40个循环：95℃，15s；60℃，1min。所述试剂盒能够通过检测血浆中LncRNAENST00000542697表达水平来诊断多环芳烃暴露人群是否有氧化应激损伤。本专利技术具有如下优点：(1)本专利技术提供的分子标记可以快速检测出与多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的风险的相关LncRNA，及早评估人群在多环芳烃暴露的情况下氧化应激的严重程度。(2)本方法使用微滴式数字PCR定量检测中相关LncRNA的方法，可以检测血浆中极低量的RNA，结果准确可靠。(3)多环芳烃暴露人群相关LncRNA的检出，发现在多环芳烃暴露的情况下对人群的氧化应激严重程度，为及时采取相关措施提供科学依据。附图说明图1：差异LncRNA筛选。图2为血浆LncRNAENST00000542697表达筛选，12对多环芳烃暴露人群与对照人群，匹配年龄、性别和吸烟状态。图3为尿总多环芳烃与血浆LncRNAENST00000542697的箱式图，在403位多环芳烃工作者中，测试了尿总多环芳烃与血浆LncRNAENST00000542697，尿总多环芳烃按从小到大划分成五个分位，各组进行两两比较的方差分析，用星号(*)表示有统计学差异，且两个指标均以自然对数为底进行转换。图4-A为血浆LncRNAENST00000542697与8-羟基脱氧鸟苷，图4-B为血浆LncRNAENST00000542697与8-异前列腺素-F2α，与氧化应激各指标(8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码RNA，其特征在于：所述长链非编码RNA为ENST00000542697，所述ENST00000542697的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤后的长链非编码RNA，其特征在于：所述长链非编码RNA为ENST00000542697，所述ENST00000542697的核酸序列如SEQIDNO:1所示。2.如权利要求1所述的长链非编码RNA在检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的分子标志物中的用途。3.一种引物，其特征在于，用于检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的如权利要求1所述的长链非编码RNA表达水平，ENST00000542697的上游引物核苷酸序列为：5'-AAATGGGCTAACACTGAAAGAACC-3'，下游引物核苷酸序列为：5'-CCTGCCGAGGCTTGGATTAC-3'。4.一种检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，其特征在于：包含权利要求3所述的引物。5.根据权利要求4所述的检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括内参基因β-actine的引物和探针序列、ENST00000542697的探针序列；内参基因β-actine的上游引物序列：5’-CATCCTCACCCTGAAGTA-3’，内参基因β-actine的下游引物序列：5’-AGGTCTCAAACATGATCTG-3’，内参基因β-actine的探针序列：5’-ACGGCATCGTCACCAACTGG-3’，HEX荧光基团，BHQ淬灭基团；ENST00000542697的探针序列：5'-TGCAGAATCTCAGCAACGTCACAGAGG-3'，FAM荧光基团，BHQ淬灭基团。6.根据权利要求4或5所述的检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，其特征在于还包括反转录所需试剂：反转录缓冲液、dNTP混合液、RNA酶蛋白质抑制剂、反转录酶和无核酸酶纯水。7.根据权利要求4或5所述的检测多环芳烃暴露人群氧化应激损伤的试剂盒，其特征在于还包括微滴式数字PCR所需的下列试剂：微滴式数字PCR预混液，无核酸酶纯水，微滴分析专用油，微滴发生专用油。8.一种检测多环芳烃...

【专利技术属性】
技术研发人员：方秦，张晓敏，朱锐，刘苗，郭文婷，杨良乐，来雪峰，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42