一种增强杆状病毒感染性的方法及其重组杆状病毒和应用技术

本发明专利技术公开了一种增强杆状病毒感染性的方法及其重组杆状病毒和应用，该方法将埃博拉GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，产生的重组病毒经过测定，可以明显提高杆状病毒的滴度，增强感染性，可以在病毒繁殖扩增过程中，加入少量病毒可达到高的感染性，节省生产成本。本发明专利技术的使用不但可以降低杆状病毒扩增成本，同时获得的高感染性重组杆状病毒也可改善杆状病毒作为生物杀虫剂杀虫速度慢等缺点；本发明专利技术还可促进昆虫杆状病毒与宿主细胞相互作用、杆状病毒受体以及杆状病毒入侵宿主的机制等研究的发展，本发明专利技术提供的方法简单明了，易于理解、操作简单易行，效率高。

【技术实现步骤摘要】
一种增强杆状病毒感染性的方法及其重组杆状病毒和应用
本专利技术属于基因工程及生物防治领域，具体涉及一种增强杆状病毒感染性的方法及其重组杆状病毒和应用。
技术介绍
杆状病毒基因组为单一闭合双链环状DNA，大小为80～180kb，因其病毒粒子为杆状，因此被称为杆状病毒，专一性感染节肢动物的病原微生物。近年来杆状病毒已被广泛应用于外源蛋白表达、基因治疗及生物杀虫剂等方面。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AutographacalifornicanucleopolyhedrovirusAcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，BmNPV)是研究的最为广泛的两种昆虫杆状病毒。AcMNPV表达系统生产的人乳头瘤病毒疫苗(CervarixTM，葛兰素史克)已经上市，并取得非常好的免疫效果；还有一些商品化的杀虫剂，也已经广泛应用于农业害虫防治。自1993年由中国科学院武汉病毒研究所和湖北蒋湖农场登记的中国第一个昆虫病毒杀虫剂产品-棉铃虫核型多角体病毒杀虫剂以来，在中国登记的NPV杀虫剂有效成分达10多种，产品有38个(中国农药信息网)。目前，中国推广应用的杀虫剂主要有茶尺蠖NPV、茶毛虫NPV和茶刺蛾NPV。国外报道巴西已经有约100万公顷大豆种植用黎豆夜蛾NPV作为杀虫剂。就如何提高杆状病毒外源蛋白的表达量和杀虫力，科学家也进行了大量的研究方面，比如敲除一些杆状病毒基因组上与病毒复制非必需的一些基因来改良系统提高表达量，也有插入一些外源毒素基因比如钳蝎毒素基因来提高杀虫能力。不管是改良表达效率还是提高杀虫能力，重组病毒均需要大量的扩增繁殖，才能应用于外源蛋白的生产或者杀虫剂的制备，在重组病毒制备及扩增过程中，需要消耗大量的人力财力，如果能在病毒感染的过程中，应用一定手段提高感染效率，即用少量的病毒可以繁殖扩增更多的病毒，达到提高表达量或杀虫能力、节省人力物力及降低成本的目的。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种增强杆状病毒感染性的方法，该方法是将埃博拉GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，产生的重组病毒经过测定，可以明显提高杆状病毒的滴度，增强感染性，可以在病毒繁殖扩增过程中，加入少量病毒可达到高的感染性，节省生产成本。目前，没有埃博拉GP蛋白应用于提高杆状病毒滴度的任何文献报道和专利申请。本专利技术公开的方法易于掌握，一次性构建的重组病毒，可以永久应用。本专利技术是一种提高杆状病毒滴度的新方法，用于提高杆状病毒的滴度，即将埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，即可显著提高杆状病毒的滴度，进而提高其感染性，该方法简单明了，便于操作，成本低廉，易于推广，提高效率显著。本专利技术还提供一种高感染性重组杆状病毒及其应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种增强杆状病毒感染性的方法，其特征在于，由埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，提高杆状病毒感染性。其中，所述埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，即可显著提高杆状病毒的滴度，进而提高其感染性。作为优选，所述埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上具体为：扩增埃博拉GP蛋白基因，插入到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的pFastBacDUAL系列质粒中(Bac-to-BaculovirusExpressionSystems,InvitrogenTM)，用构建的携带埃博拉GP蛋白基因的pFastBacDUAL质粒转化含有杆状病毒Bac-to-Bac系统及辅助质粒表达转座酶的DH10B感受态细胞，使得埃博拉GP蛋白基因转座到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的Tn7转座插入位点。作为优选，所述埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上具体为：扩增埃博拉GP蛋白基因，构建重组打靶载体，载体中在埃博拉GP蛋白基因两侧克隆打靶的同源臂(同源臂和复制缺陷杆状病毒缺失的基因同源)，将构建好的载体和复制缺陷型的杆状病毒DNA共同转染昆虫细胞，通过空斑筛选重组病毒，即通过同源重组使得复制缺陷的病毒重新获得复制能力，使得埃博拉GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上。本专利技术所述的高感染性重组杆状病毒，通过转座方式、同源重组方式或其它方式将埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，获得重组杆状病毒。本专利技术将埃博拉的GP蛋白基因插入到杆状病毒基因组上与病毒复制不相关或不影响病毒的复制即可，本专利技术中优选将埃博拉GP蛋白基因转座到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的Tn7转座插入位点。其中，所述重组杆状病毒的一步生长曲线显著升高，外源基因的表达量显著增加。本专利技术所述的高感染性重组杆状病毒在制备快速生物杀虫剂中的应用。在本专利技术总体过程包括1、构建重组病毒，主要通过两种方法构建重组病毒；2、比较两种病毒感染后产生的子代病毒；3、比较两种病毒外源蛋白的表达量。1、构建重组病毒a、转座方式构建重组病毒：设计一对引物，扩增埃博拉GP蛋白基因，插入到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的pFASTBACDUAL系列质粒中，用构建的携带埃博拉GP蛋白基因的pFASTBACDUAL质粒转化含有杆状病毒Bac-to-Bac系统及辅助质粒(表达转座酶)的DH10B感受态细胞，使得埃博拉GP蛋白基因转座到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的Tn7转座插入位点，通过抗生素、蓝白斑筛选阳性菌落，提取DNA，进一步通过PCR鉴定，获取正确的重组Bacmid，提取DNA，转染昆虫细胞，观察细胞的病变情况，72小时后收获病毒，继续按照常规手段感染昆虫细胞进行病毒扩增，72小时后收获病毒，利用终点稀释法测定病毒滴度，4℃避光保存，用于本专利所有方法中。b、同源重组方法构建重组病毒：设计一对引物，扩增埃博拉GP蛋白基因，构建重组打靶载体，载体中在埃博拉GP蛋白基因两侧克隆打靶的同源臂(同源臂和复制缺陷杆状病毒缺失的基因同源)，将构建好的载体和复制缺陷型的杆状病毒DNA共同转染昆虫细胞，通过空斑筛选重组病毒，即通过同源重组使得复制缺陷的病毒重新获得复制能力，这样埃博拉GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上。将空斑筛选的病毒继续感染昆虫细胞，扩增病毒，收获病毒，测定病毒滴度，4℃避光保存备用。2、比较两种病毒感染后产生的子代病毒分别用相同感染复数的重组病毒和对照病毒感染昆虫细胞，感染后不同时间点取样，用终点稀释法测定各个时间点样品病毒滴度，比较两种病毒的一步生长曲线。实验重复三次，用Excel2016统计显著性。3、比较两种病毒外源蛋白的表达量将报告基因egfp，通过转座方式插入杆状病毒基因组，转染细胞，收获重组病毒，终点稀释法测定滴度后，相同感染复数病毒感染细胞，感染后72h收集细胞，悬浮于1mlPBS，超声破碎4min，12000转离心5min，上清用于光谱分析，比较EGFP蛋白表达量。本专利技术将埃博拉病毒糖蛋白基因插入到杆状病毒基因组上，形成的新病毒不仅携带自身的表面糖蛋白，而且含有埃博拉病毒的糖蛋白，这样提高了病毒的感染性。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术首次公开了一种能显著提高杆状病毒感染性的方法，用于提高杆状病毒的滴度，将埃博拉的GP蛋白基因插入杆状病毒基因组后，能显著的提高杆状病毒感染效率。本专利技术的使用不但可以降低杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强杆状病毒感染性的方法，其特征在于，将埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，提高杆状病毒感染性。

【技术特征摘要】
1.一种增强杆状病毒感染性的方法，其特征在于，将埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，提高杆状病毒感染性。2.根据权利要求1所述的增强杆状病毒感染性的方法，其特征在于，所述埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，即可显著提高杆状病毒的滴度，进而提高其感染性。3.根据权利要求1所述的增强杆状病毒感染性的方法，其特征在于，所述埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上优选具体为：扩增埃博拉GP蛋白基因，插入到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的pFastBacDUAL系列质粒中，用构建的携带埃博拉GP蛋白基因的pFastBacDUAL质粒转化含有杆状病毒Bac-to-Bac系统及辅助质粒表达转座酶的DH10B感受态细胞，使得埃博拉GP蛋白基因转座到杆状病毒Bac-to-B...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝碧芳，罗得勇，黄金山，沈兴家，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32