一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法技术

一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，属于分析化学技术领域。本发明专利技术首先将氧四环素适体(APTOTC)与生物素标记的探针CPOTC退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面；探针SPOTC和HPOTC修饰于金纳米颗粒(AuNPs)表面。当体系中存在氧四环素(OTC)时，OTC与APTOTC的特异性结合并使APTOTC脱离SDB，紧接着CPOTC则与AuNPs修饰的HPOTC杂交形成SDB‑AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SPOTC结合SAv‑HRP后可催化TMB‑H2O2溶液变色，利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度梯度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品370nm处紫外吸光度，即可实现氧四环素浓度的检测。该方法具有高灵敏度，低成本，快速、易操作等特点，可实现样品中氧四环素的灵敏测定。

A colorimetric method for determination of tetracycline residues in milk

【技术实现步骤摘要】
一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法
本专利技术是一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，特别是牛奶中氧四环素残留的检测方法，属于分析化学领域。
技术介绍
氧四环素是一种四环素类广谱抗生素和生长促进剂，常常被用作饲料添加剂，由于氧四环素的不合理使用以及不遵守休药期(WDT)等，极易残留在牛奶和动物组织中，长期食用必然会危及人类的健康。世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国政府对牛奶中氧四环素的残留都做出了严格的规定，控制氧四环素的使用。磁珠分离技术与其他分离技术(如色谱分离，离心分离和膜分离)相比具有高通量，低成本，快速和简化操作的显着优点。金纳米颗粒(AuNPs)因其独特的物理和化学性质，被广泛用于信号放大的纳米材料之一。可在其表面偶联其他许多功能分子，成功保持其原有生物特性的同时，拥有更好的稳定性。通过DNA探针修饰磁珠识别抗生素和AuNPs信号放大可建立一种超灵敏建立高效，实用的、简便、快速、灵敏检测氧四环素的方法。目前抗生素分析的方法包括ELISA，色谱，质谱，毛细管电泳，SERS，表面等离子体共振(SPR)和电化学生物传感器学。这些方法中的大多数都有一定的缺陷，繁琐的样本预处理程序、免疫化学方法的试剂昂贵、检测时间长、复杂的仪器。因此，利用磁珠快速分离收集与金纳米颗粒的信号放大的优势建立一种专一性强、操作简便、快速、灵敏的氧四环素检测方法显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是将磁珠快速分离收集与金纳米颗粒的信号放大的优势结合起来，建立一种简单、成本低廉，极高灵敏度的应用于实际样品中氧四环素浓度的检测方法。本专利技术的技术方案：一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，首先将氧四环素适体(APTOTC)与生物素标记的探针CPOTC退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面；探针SPOTC和HPOTC修饰于金纳米颗粒(AuNPs)表面。当体系中存在氧四环素(OTC)时，OTC与APTOTC的特异性结合并使APTOTC脱离SDB，紧接着CPOTC则与AuNPs修饰的HPOTC杂交形成SDB-AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SPOTC结合SAv-HRP后可催化TMB-H2O2溶液变色，利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度的关系，测定一系列标准浓度的氧四环素所得的紫外吸光度的大小，绘制标准曲线，即可实现实际样品中氧四环素含量的灵敏检测。方法包括以下步骤：磁珠的预处理、探针修饰SDB的制备、金纳米颗粒的制备、探针修饰AuNPs的制备、样品孵育，紫外分光光度计检测。(1)磁珠的预处理取10mg/mL的链霉亲和素偶联的磁珠(SDB)原液于EP管中，加入含有1mMEDTA，2MNaCl的10mMTris-HCl(pH7.5)洗涤磁珠3次，最后用10mMPBS(pH7.0)重悬SDB，得到2mg/mL干净磁珠备用。(2)探针修饰SDB的制备将20μL10μMAPTOTC和20μL10μMCPOTC加入到210μL含0.3MNaCl，10mMPBS(pH7.0)溶液中，得到总体积250μL的混合液，将该混合液于90℃加热2min后缓慢降至室温。在250μL的混合液加入上述(1)中预处理的50μL磁珠溶液混匀，在37℃孵育90min，用10mMPBS(pH7.0)洗涤3次后，加入500μL2％BSA室温孵育1h后，将CPOTC/APTOTC修饰好的SDB重悬于50μL10mMPBS(pH7.0)中得到50μL2mg/mLCPOTC/APTOTC修饰的SDB。上述APTOTC的序列为：5′-CGTACGGAATTCGCTAGCGGGCGGGGGTGCTGGGGGAATGGAGTGCTGCGTGCTGCGGGGATCCGAGCTCCACGTG-3′上述CPOTC的序列为：5′-Biotin-ATATATATATCACGTGGAGCTCGGATCCCCGCAGCACGCAGCACTCCATTCCCCCAGCACCCCCGCCCGCTAGCGAATTCCGTACG-3′(3)金纳米颗粒的制备制备所需的所有玻璃器皿必须在新配置王水(HNO3∶HCl＝3∶1)中浸泡30min后，用大量的双蒸水洗涤并在烘烤箱中烘干备用。金纳米颗粒的制备过程如下：配制100mL0.01％的氯金酸加入三颈瓶中，搅拌并加热至沸腾。待其煮沸后，在剧烈搅拌下迅速加入3.5mL1％的柠檬酸三钠，继续加热搅拌15min后待溶液变成酒红色关闭加热器，继续搅拌30min，关闭搅拌器，待溶液冷却至室温后，将制备好的金纳米颗粒(AuNPs)存放于棕色试剂瓶中并放置在4℃冰箱保存。(4)探针修饰AuNPs的制备将100μL上述(3)中制备的AuNPs与4μL10μM的HPOTC、40μL10μM的SPOTC以及356μLpH值为7.0的10mMPBS制成500μL混合液。将该混合液于37℃孵育1h后，12000rpm，4℃离心20min，弃上清485μL后，加485μL10mMPBS(pH7.0)重悬(重复离心洗涤3次)，得到总体积为500μL修饰SPOTC/HPOTC的金纳米颗粒。上述HPOTC的序列为：5′-SH-AAAAAACGTACGGAATTC-3′上述SPOTC的序列为：5′-Biotin-ATATATATATCACGTGGAGCTCGGAAAAAAA-SH-3′(5)样品孵育将上述(2)中制备的2mg/mLCPOTC/APTOTC修饰的SDB4μL与4μL不同浓度的OTC和2μL含0.1MNaCl的10mMPBS(pH7.4)制成混合液，将该混合液于37℃孵育1h，用10mMPBS(pH7.0)清洗3次，加入12.5μL上述(4)中制备的SPOTC/HPOTC修饰的金纳米颗粒于37℃孵育1h后，用100μL10mMPBS(pH7.0)清洗3次，用10mMPBS(pH7.0)重悬。(6)紫外分光光度计检测向上述(5)中溶液加入0.5μL的SAv-HRP(0.01mg/mL)于37℃孵育1h，用200μL10mMPBS(pH6.0)清洗5次，加600μLTMB-H2O2溶液重悬于37℃孵育30min观察颜色变化并检测370nm处紫外吸光度。氧四环素的浓度在10-6至105pg/mL时，溶液颜色从透明逐渐变为深蓝色，在370nm处的吸光度随着氧四环素浓度的升高而增加，370nm处紫外吸光度与氧四环素的浓度存在良好线形关系，符合定量要求。本专利技术的有益效果：①本方法利用磁珠的快速分离、AuNPs介导的信号放大和选择性生物比色传感器的优势，实现了牛奶中氧四环素的检测，灵敏度极高，对牛奶中氧四环素宽范围线性内定量、灵敏检测具有重要意义；②在方法学上具有普遍借鉴意义，通过替换探针DNA序列，就可设计出多种抗生素检测的高灵敏度成本低，操作方便，无需繁琐的程序分析方法。附图说明图1为一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法的原理图图2为一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法的专一性图图3为不同浓度的氧四环素存在下，紫外吸光度与氧四环素的浓度关系图具体实施方式实施例1.一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法专一性的测定在最佳实验条件下，进行了体系专一性验证。将上述方法步骤(2)中制备的CPOTC/APTOTC修饰的SDB4μL与4μL不同种类的抗生素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，属于分析化学技术领域。本专利技术首先将氧四环素适体(APTOTC)与生物素标记的探针CPOTC退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面，探针SPOTC和HPOTC修饰于金纳米颗粒(AuNPs)表面；当体系中存在氧四环素(OTC)时，OTC与APTOTC的特异性结合并使APTOTC脱离SDB，紧接着CPOTC则与AuNPs修饰的HPOTC杂交形成SDB‑AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SPOTC结合SAv‑HRP后可催化TMB‑H2O2溶液变色，利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度梯度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品370nm处紫外吸光度，即可实现氧四环素浓度的检测。

【技术特征摘要】
1.一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，属于分析化学技术领域。本发明首先将氧四环素适体(APTOTC)与生物素标记的探针CPOTC退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面，探针SPOTC和HPOTC修饰于金纳米颗粒(AuNPs)表面；当体系中存在氧四环素(OTC)时，OTC与APTOTC的特异性结合并使APTOTC脱离SDB，紧接着CPOTC则与AuNPs修饰的HPOTC杂交形成SDB-AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SPOTC结合SAv-HRP后可催化TMB-H2O2溶液变色，利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度梯度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品370nm处紫外吸光度，即可实现氧四环素浓度的检测。2.根据权利要求1所述的一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，其特征是将氧四环素适体(APTOTC)与生物素标记的探针CPOTC退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面，将20μL10μMAPTOTC和20μL10μMCPOTC加入到210μL含0.3MNaCl，pH值为7.0的10mMPBS中，90℃加热2min后缓慢降至室温，之后加入50μLSDB，37℃孵育90min，用pH值为7.0的10mMPBS洗涤3次后，加入500μL2％BSA室温孵育1h后，将CPOTC/APTOTC修饰好的SDB重悬于50μLpH值为7.0的10mMPBS溶液中。3.根据权利要求1所述的一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，其特征是探针SPOTC和HPOTC修饰于金纳米颗粒(AuNPs)表面，将100μL的AuNPs与4μL10μM的HPOTC、40μL10μM的SPOTC以及356μLpH值为7...

【专利技术属性】
技术研发人员：许媛媛，苗晋锋，张源淑，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32