一种提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物及其转染方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物，该组合物包括温度敏感型原位凝胶，其低温时为自由流动的液体，温度升高时形成凝胶。包含温度敏感型原位凝胶和目的基因的病毒以凝胶状态包裹在血管组织周围，能够持续释放病毒，增加术后血管组织与病毒的接触时间，提高病毒的转染效率。该组合物中还可以包含胰蛋白酶，增加血管的通透性，有利于病毒通过血管外膜进入组织。同时，本发明专利技术还提供了一种转染移植静脉组织的方法，该方法简单、稳定、便于操作。本发明专利技术提供的组合物应用于移植静脉再狭窄局部基因治疗中，能够提高携带目的基因病毒转染移植静脉组织的效率。并且该组合物能够显著提高腺相关病毒6血清型转染移植静脉血管组织的效率。

A Compound for Improving the Efficiency of Virus Transfection into Vein Graft Tissue and Its Transfection Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物及其转染方法与应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物及其转染方法与应用。技术背景随着人民生活水平的提高、饮食结构变化和人口老龄化的出现，冠状动脉硬化和周围动脉粥样硬化闭塞症已成为中老年人的常见病，严重者可危及生命或截肢致残，现已成为我国乃至全世界的主要致死原因。冠状动脉搭桥术(CABG)是目前治疗冠心病的最常用和最有效的办法之一。CABG术，俗称“冠脉搭桥心脏术”，是取病人本身的血管或者血管替代品将狭窄冠状动脉的远端和主动脉连接起来，让血液饶过狭窄的部分到达缺血的部位，改善心肌血液供应以缓解心绞痛症状，提高心功能，从而提高生活质量延长寿命。但移植静脉再狭窄是CABG术后最常见和最严重的问题，使CABG术后远期通畅率仅为40％～60％。目前，移植静脉再狭窄已成为困扰世界范围内血管外科的难题之一，常用的防止和治疗方法有以下几种：1、口服及静脉用药。该方法已在许多专利中记载，如专利CN101969978公开一种预防或治疗再狭窄的口服药物，专利CN107485683A提供了防治心脏术后并发症的中西药复方颗粒剂等。目前搭桥术后病人口服阿司匹林和替格瑞洛双抗凝可以有效的提高搭桥术后通畅率，但移植静脉再狭窄的发生率依然高达10％以上，且无法对再狭窄的病因进行针对性治疗。对于血管条件较差或术中行冠脉内膜剥脱的病人，术后可以静脉注射肝素抑制桥血管内血栓形成，但术后静脉应用肝素只能抑制围术期血栓形成而无法抑制远期桥血管粥样硬化，且易导致术后出血性并发症。2、改良扩张液。隐静脉离取后的扩张已经成为CABG术中的一项常规操作，目前常用的大隐静脉扩张液多为简单的肝素生理盐水，仅有简单的扩张作用。改良扩张液为GV扩张液，其主要的成分是三硝酸甘油和维拉帕米。该扩张液能更好的保护血管内皮细胞的功能，明显减少单位面积死亡的数量，从而在一定程度上提高静脉桥的远期通畅率，但同样GV扩张液的作用原理使其保护效果局限于术后短期，且扩张液无法避免使用者注射量过大引起的机械扩张损伤。3、基因治疗。基因治疗是指将目的基因导入到病毒内制成复合体，再通过病毒将目的基因准确地转染至移植静脉组织内，使其有效表达，从而达到防治或减轻再狭窄的目的。随着人类基因图谱的揭示，基因治疗CABG术后移植静脉再狭窄成了一个炙手可热的话题，其优势在于可以在CABG术中从大隐静脉采集完成到开始移植吻合的窗口期内(约40-60分钟)只针对移植静脉血管进行局部基因治疗，而不会干扰其他器官以及整个循环系统。如专利CN106367417公开了一种特异性靶向孤儿核受体Nur77基因(孤儿核受体Nur77与血管再狭窄相关，可以以Nur77基因作为标靶)的siRNA分子，其可以阻断Nur77基因的mRNA转录，阻止基因的翻译，从而根本上抑制Nur77的表达，最终达到抑制发生血管再狭窄的目的。但基因治疗关键的环节之一就是如何高效率地将外源基因转染移植静脉组织内并使其稳定表达。虽然根据不同血清型AAV对各组织器官细胞的亲和性不同，已有报道在心肌、肝脏、肺脏、眼、脑、肌肉等组织的有效转染，但目前尚缺乏在血管组织中高效转染的方法。尤其是血管组织的特殊性，不便于仿效其他组织所用的局部注射法转染，并且，因血管外膜结缔组织的屏障作用，使转病毒染效率大大降低，达不到足够的治疗效果。因此，如何将携带有目的基因的病毒表达载体高效、安全的转染移植静脉组织仍是移植静脉再狭窄基因治疗中一个尚未解决的重要技术难题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物，该组合物包括温度敏感型原位凝胶。温度敏感型原位凝胶是依据温度变化而发生相转变的一种原位凝胶，具有低临界溶液温度(LCST)，低温时可形成足够多的氢键而呈现自由流动的液体状态，随温度的升高，氢键数目减少到某一临界点，导致体系发生相变而形成凝胶。常见的温度敏感型原位凝胶有N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)，木聚糖，乙基羟乙基纤维素(EHEC)，聚乙二醇/聚乳酸羟乙酸嵌段共聚物(PEG/PLGA)，聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物(PEO/PPO)等。在转染移植静脉组织的过程中，包含温度敏感型原位凝胶和目的基因的病毒以凝胶状态包裹在血管组织周围，能够持续释放携带目的基因的病毒，增加术后移植静脉组织与病毒的接触时间，从而提高携带目的基因的病毒转染效率。优选的，温度敏感型原位凝胶是质量分数大于15％的泊洛沙姆407溶液。泊洛沙姆407，英文名称为Poloxamer-407，又称普朗尼可F127，英文名称PluronicF127。它是一种典型的温度敏感型原位凝胶，其相对分子量为9840～14600，包括70％的聚氧乙烯和30％的聚氧丙烯，在水、乙醇、异丙醇等溶剂中易溶。泊洛沙姆407在一定浓度范围内，非牛顿指数与黏度系数随着温度的升高分别呈现递减和递增的趋势，即温度的提高引起触变性的增强、黏度的变大。当泊洛沙姆407的质量分数大于15％时，低温时为自由流动的液体，温度升高时形成凝胶，因此本专利技术选择该质量分数范围内的泊洛沙姆407溶液。优选的，组合物包括质量分数大于15％～30％的泊洛沙姆407溶液和胰蛋白酶。泊洛沙姆407的流变学性质与浓度有密切关系，当质量分数大于30％时，泊洛沙姆407在4℃冰箱中仍形成凝胶。为了使泊洛沙姆407溶液满足室温为液体便于应用、哺乳动物体内呈现凝胶便于持续释放携带目的基因的病毒的需求，因此选择质量分数在15％～30％之间的泊洛沙姆407溶液。并且，移植静脉组织中血管外膜组织致密，影响携带目的基因的病毒通过血管外膜到达血管组织内部，而胰蛋白酶可以增加血管的通透性，有利于病毒通过血管外膜进入血管组织，进一步提高携带目的基因的病毒的转染效率。优选的，泊洛沙姆407溶液的质量分数为15.25％，16.00％，16.69％，18.00％，20.00％和25.00％中的一种或多种。经过大量的实验发现，当泊洛沙姆407溶液的质量分数为15.25％，16.00％，16.69％，18.00％，20.00％和25.00％时，在低于16℃～30℃时呈液体状态，高于35℃时呈凝胶状态。由于哺乳动物的体温均在37℃左右，这些浓度的泊洛沙姆407溶液能够满足哺乳动物体外为液体便于应用、体内呈现凝胶便于持续释放病毒的目的。优选的，胰蛋白酶的质量分数为0.1％～1.5％。经过大量试验不断优化，发现当胰蛋白酶的质量分数为0.1％～1.5％时，能够进一步提高病毒转染移植静脉组织的效率。优选的，当温度敏感型原位凝胶是质量分数为20.00％的泊洛沙姆407溶液，胰蛋白酶的质量分数为0.1％～1.0％时，不仅能够显著高病毒转染移植静脉组织的效率，而且对移植静脉本身的生物学特性影响小。优选的，当温度敏感型原位凝胶是质量分数为20.00％的泊洛沙姆407溶液，胰蛋白酶的质量分数为0.25％，不仅能够显著高病毒转染移植静脉组织的效率，而且基本不影响移植静脉本身的生物学特性，是本专利技术大量实验中得到的最优结果。进一步的，本专利技术提到的病毒包括腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒或单纯性疱疹病毒中的一种或多种。这些病毒都是作为病毒载体，将目的基因准确地转染至移植静脉组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物，其特征在于，所述组合物包括温度敏感型原位凝胶。

【技术特征摘要】
1.一种提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物，其特征在于，所述组合物包括温度敏感型原位凝胶。2.根据权利要求1所述的提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物，其特征在于，所述温度敏感型原位凝胶是质量分数大于15％的泊洛沙姆407溶液。3.根据权利要求2所述的提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物，其特征在于，所述组合物包括质量分数为15％～30％的泊洛沙姆407溶液和胰蛋白酶。4.根据权利要求3所述的提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物，其特征在于，所述泊洛沙姆407溶液的质量分数为15.25％，16.00％，16.69％，18.00％，20.00％和25.00％中的一种或多种，所述胰蛋白酶的质量分数为0.1％～1.5％。5.根据权利要求4所述的提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物，其特征在于，所述温度敏感型原位凝胶是质量分数为20.00％的泊洛沙姆407溶液，所述胰蛋白酶的质量分数为0.1％～1.0％。6.根据权利要求5所述的提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物，其特征在于，所述温度敏感型原位凝胶是质量分数为20.00％的泊洛沙姆407溶液，所述胰蛋白酶的质量分数为0.25％。7.根据权利要求1～6任一所述的提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物，其特征在于，所述病毒包括腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒或单纯性疱疹病毒中的一种或多种。8.根据权利要求7所述的提高病毒转染移植静脉组织效率的组合物，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小文，李送，钟昌明，黄春，向小勇，蒋迎九，吴庆琛，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50