采用串联sgRNA同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性的方法技术

本发明专利技术提供了一种采用串联sgRNA策略同步激活猪多个内源性干细胞因子的方法，首先利用杀稻瘟菌素和潮霉素药物筛选并构建了能稳定表达dCAS‑VP64和MS2‑P65‑HSF1的PK‑15细胞株（PK‑15‑dCas9‑MS2）。分别设计和构建能靶向猪干细胞因子Oct4、Sox2、Klf4、c‑Myc和miR‑302/367启动子的sgRNAs，在上述细胞上进行高活性的sgRNA筛选，将基因转录激活效率最高的5条sgRNA进行串联组合和构建表达载体，将其导入PK‑15‑dCas9‑MS2细胞中，同步激活猪OSKM和miR‑302/367转录活性，该技术对诱导产生猪的iPSC具有潜在的应用价值。

Synchronous activation of porcine endogenous stem cell factor transcriptional activity by tandem sgRNA

【技术实现步骤摘要】
采用串联sgRNA同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及采用串联sgRNA的策略同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性的方法。
技术介绍
2006年8月，Takahashi和Yamanaka最早通过逆转录病毒将鼠源的KLF4、Sox2、Oct-3/4和c-Myc(OSKM)这4个转录因子导入到小鼠的成纤维细胞中(MouseembryonicfibroblastscellMEF细胞)，MEF细胞经重编程后产生诱导性多能干细胞(iPSC)。在此基础上，他们将这4个转录因子载体转入到人的皮肤成纤维细胞中，并且成功的诱导出人的iPSC。早期iPSC诱导效率较低且周期长，随着相关技术的不断发展，Anokye-Danso等人发现miR-302/367可以把克隆的数量有效地提高了两个数量级。OSKM和miR-302/367在iPSC诱导过程中有重要作用。研究发现，将人、小鼠或猪的OSKM和miR-302/367基因导入猪的成纤维细胞，可诱导产生人或小鼠样iPSC克隆。但目前猪的iPSC效率低，且外源过表达OSKM和miR-302/367能诱导产生iPSC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用串联sgRNA同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建稳定表达CRISPR激活元件dCAS‑VP64和MS2‑P65‑HSF1的PK‑15细胞系：通过慢病毒感染的方法将包含CRISPR SAM激活元件的lenti dCAS‑V P64_Blast和lenti MS2‑P65‑HSF1_Hygro导入PK‑15细胞，慢病毒感染2天后，在细胞培养液中同时添加10μg/ml的杀稻瘟菌素和500μg/ml的潮霉素，通过这两种药物筛选6天后，可获得同时稳定表达有lenti dCAS‑VP64_Blast和lenti MS2‑P65‑HSF1_Hygr...

【技术特征摘要】
1.一种采用串联sgRNA同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建稳定表达CRISPR激活元件dCAS-VP64和MS2-P65-HSF1的PK-15细胞系：通过慢病毒感染的方法将包含CRISPRSAM激活元件的lentidCAS-VP64_Blast和lentiMS2-P65-HSF1_Hygro导入PK-15细胞，慢病毒感染2天后，在细胞培养液中同时添加10μg/ml的杀稻瘟菌素和500μg/ml的潮霉素，通过这两种药物筛选6天后，可获得同时稳定表达有lentidCAS-VP64_Blast和lentiMS2-P65-HSF1_Hygro的PK-...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢胜松，周玲，刘敏，苗义良，刘海龙，徐德全，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42