能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒、CAR-T细胞、构建方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，特别涉及能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒、CAR‑T细胞、构建方法及其应用。该T细胞可同时表达针对霍奇金淋巴癌细胞表面的肿瘤相关抗原LMP1、CD30的抗体Anti‑LMP1、Anti‑30，其技术要点主要包括首先构建能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒，之后对该质粒进行慢病毒包装，并感染T细胞，得到CAR‑T细胞，用该CAR‑T细胞杀灭EB病毒感染的霍奇金淋巴癌细胞。

Plasmids, CAR-T cells, construction methods and applications for simultaneous expression of LMP1 and CD30 dual-target CAR

【技术实现步骤摘要】
能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒、CAR-T细胞、构建方法及其应用
本专利技术属于生物医药
，特别涉及能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒、CAR-T细胞、构建方法及其应用。
技术介绍
EB病毒是一种全球性分布的双链DNA病毒，被EB病毒感染后，人体自身的免疫系统虽然可以迅速清除被病毒感染的细胞，但是仍有部分EB病毒以潜伏形式终身存在于静息期B细胞中。当机体免疫系统受到抑制时，这些被EB病毒感染的细胞出现增殖，释放EB病毒，被感染的B细胞可能转化为恶性肿瘤细胞，霍奇金淋巴癌便是其中一种。潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein1，LMP1)是EB病毒编码的一种唯一确定具有转化能力的蛋白。CD30是肿瘤坏死因子受体超家族(tμmornecrosisfactorreceptorsμperfamily，TNFRSF)成员之一，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，高表达于霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma，HL)，低表达于非病理状态下活化的T细胞、B细胞表面，而正常细胞不表达。嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞是一种结合T细胞免疫治疗和抗体靶向治疗的治本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：依次连接抗CD30的轻链、抗LMP1单链抗体的轻链、抗LMP1单链抗体的重链、抗CD30的重链、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区、以及CD3ζ胞内区，并合成基因序列片段；S2：将步骤S1中得到的基因序列片段连接至慢病毒表达载体PTK881，得到能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒PTK‑hCD30‑hLMP1。

【技术特征摘要】
1.一种能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：依次连接抗CD30的轻链、抗LMP1单链抗体的轻链、抗LMP1单链抗体的重链、抗CD30的重链、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区、以及CD3ζ胞内区，并合成基因序列片段；S2：将步骤S1中得到的基因序列片段连接至慢病毒表达载体PTK881，得到能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒PTK-hCD30-hLMP1。2.一种利用权利要求1所述的构建方法构建的能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒。3.一种如权利要求2所述的能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒在制备治疗EB病毒感染的试剂盒或试剂中的应用。4.一种CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：Sa：利用权利要求1所述的构建方法构建能同时表达LMP1和CD30双靶点CAR的质粒；Sb：慢病毒包装，于37℃含5％CO2培养箱中用DEME完全培养基培养293T细胞；将混合有步骤Sa中制备的质粒的三质粒包装系统的DEME低糖培养基与聚乙烯亚胺混合并摇匀，于37℃孵育；将孵育后的混合液置于37℃含5％CO2培养箱中培养；收集细胞培养上清液，并经滤膜过滤得到病毒初始液；Sc：病毒液浓缩，将病毒初始液与5×PEG8000NaCl混合，放置过夜；离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖兴华，王君，项园，李佳蓬，张慧敏，黄凤，戴周彤，顾潮江，张同存，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42