一种CAR-T毒性指示细胞的快速构建方法技术

本发明专利技术公开了一种CAR‑T毒性指示细胞的快速构建方法，包括以下步骤：首先，构建序列为SEQ NO：1的慢病毒质粒；其次，慢病毒质粒大提，病毒包装制备得到慢病毒；再次，慢病毒感染常用细胞X；最后，将一种或几种生物素化处理的蛋白A加入到通用细胞U中，与U细胞膜上的avidin紧密结合，得到CAR‑T毒性指示细胞；本发明专利技术的CAR‑T毒性指示细胞的快速构建方法，通过添加不同的生物素化处理的蛋白A或其组合，能够快速的将含有Luciferase基因片段的细胞U转变为多种适用于CAR‑T毒性检测的指示细胞，大大省略了繁琐的制备步骤，节省了制备时间，降低了成本。

A Rapid Construction Method of Car-T Toxicity Indicator Cells

【技术实现步骤摘要】
一种CAR-T毒性指示细胞的快速构建方法
本专利技术涉及细胞免疫治疗
，具体说是一种CAR-T毒性指示细胞的快速构建方法。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞疗法CAR-T在肿瘤治疗领域具有极大地应用前景和价值，CAR-T以其治疗高度精确性、确定的临床疗效和良好的安全性成为肿瘤治疗领域极具前景的研究方向。在医学研究和临床应用中，对CAR-T细胞毒性的测定是一个不可避免的重要问题，CAR-T细胞毒性也是衡量CAR-T产品质量的重要标准之一。目前常用的体外检测细胞毒性的方法步骤是将CAR-T细胞与靶细胞混合后，经过一段时间的培养期后，采用流式抗体标记后利用流式细胞法测定。此法面临着检测时间长、操作繁琐、误差较大等问题。荧光素酶法是一种新兴的测定CAR-T细胞毒性的方法，具体为：改造指示细胞，使其稳定表达荧光素酶，指示细胞数目和荧光素酶活力值存在定量关系，指示细胞表达肿瘤相关细胞膜靶抗原，CAR-T细胞特异性识别并结合这些肿瘤相关靶抗原，发挥杀伤作用并裂解指示细胞，荧光素酶随之释放，离心可使未裂解细胞位于沉淀中，因此通过检测上清和沉淀中的荧光素酶活力值，即可推算出裂解和未裂解细胞的数目，从而计算裂解细胞比例，表征CAR-T细胞毒性。指示细胞是荧光素酶法的关键，目前指示细胞的构建主要方法是利用携带荧光素酶基因的慢病毒去感染目的细胞(表达肿瘤细胞膜靶抗原)，经过筛选后最终获取稳定表达荧光素酶的细胞株(即指示细胞)；另外，如果无法获取表达肿瘤特异性抗原的细胞株，那么利用慢病毒感染常见细胞系，使其同时稳定表达荧光素酶和肿瘤细胞膜靶抗原也是CAR-T细胞毒性检测中常用的策略。但是无论哪种方法，首先都必须经过制备慢病毒、感染细胞并筛选稳转细胞株等一系列繁琐步骤；其次针对不同的CAR-T细胞，必然需要制备与之相应的一系列的指示细胞，整个指示细胞构建过程存在耗时较长、工作量巨大、成功率较低等问题；最后多靶点CAR-T细胞毒性的检测，要求指示细胞同时表达多个肿瘤抗原，这也意味着指示细胞构建难度随之攀升。因此，设计一种耗时短，工作量小，成功率高，步骤简便易行，甚至可以同时表达多个肿瘤抗原的CAR-T毒性指示细胞的构建方法成为亟待解决的问题。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种CAR-T毒性指示细胞的快速构建方法。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种CAR-T毒性指示细胞的快速构建方法，包括以下步骤：①构建序列为SEQNO：1的慢病毒质粒，该慢病毒质粒携带以下外源基因片段：IgKleader、avidin、CD28跨膜区、T2A序列及Luciferase；②慢病毒质粒大提，病毒包装制备得到慢病毒；③慢病毒感染常用细胞X，通过嘌呤霉素筛选获取稳定表达荧光素酶Luciferase和抗生物素蛋白avidin的通用细胞U；其中常用细胞X为工具细胞、悬浮细胞或贴壁肿瘤细胞；所述工具细胞为293FT细胞或Jurkat细胞；所述悬浮细胞为U266细胞、RPMI8226细胞、Raji细胞或K562细胞；贴壁肿瘤细胞为MCF-7细胞或MDA-MB-231细胞；④将一种或几种生物素化处理的蛋白A加入到通用细胞U中，与U细胞膜上的avidin紧密结合，得到CAR-T毒性指示细胞；生物素化处理的蛋白A为以下细胞的细胞膜靶抗原胞外域部分：CD19、CD20、CD38、CS1、CD30、PDL1、GPC3或Her2肿瘤细胞。优选的，生物素化处理的蛋白A的种类为两种或三种。优选的，常用细胞X为293FT细胞或K562细胞。优选的，生物素化处理的蛋白A为CD19、CD20和CD30的细胞膜靶抗原胞外域部分。优选的一种CAR-T毒性指示细胞的快速构建方法，步骤①中构建序列为SEQNO：1的慢病毒质粒包括以下步骤：⑴全基因合成序列为SEQNO：1的基因片段，设计上下游酶切位点分别为XhoI和BamHI；⑵用XhoI和BamHI双酶切上述基因片段，及pLVX-IRES-Puro质粒，切胶回收后连接；⑶将连接产物转化Stbl3感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素抗性的LB培养基平板；⑷挑取单克隆至含有氨苄青霉素抗性的LB培养基培养8～12小时；⑸小提质粒，XhoI和BamHI双酶切结合凝胶电泳验证，质粒测序验证其正确性后保存。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术的CAR-T毒性指示细胞的快速构建方法，通过添加不同的生物素化处理的蛋白A(肿瘤靶抗原胞外域部分)或其组合，能够快速的将含有Luciferase基因片段的细胞U转变为多种适用于CAR-T毒性检测的指示细胞，大大省略了繁琐的制备步骤，节省了制备时间，降低了成本；由于CAR-T毒性检测的指示细胞能同时具有荧光素酶和一种或多种肿瘤靶抗原，因此能作为一种抗原的指示细胞或多种抗原的指示细胞，能够满足单靶点或多靶点CAR-T细胞毒性的检测。图1为CAR-T毒性指示细胞的快速构建方法的原理示意图；图2为慢病毒质粒携带的外源基因片段示意图；图3为luciferase活力(发光强度)与细胞数目的关系示意图；图4为CD19CAR-T的杀伤效应示意图。具体实施方式本专利技术的目的是提供一种CAR-T毒性指示细胞的快速构建方法，通过以下技术方案实现：一种CAR-T毒性指示细胞的快速构建方法，原理如图1所示，包括以下步骤：①构建序列为SEQNO：1的慢病毒质粒，该慢病毒质粒携带以下外源基因片段：IgKleader(免疫球蛋白K的信号肽)、avidin(抗生物素蛋白)、CD28跨膜区、T2A序列及Luciferase(荧光素酶)，如图2所示；②慢病毒质粒大提，病毒包装制备得到慢病毒；③慢病毒感染常用细胞X，通过嘌呤霉素筛选获取稳定表达荧光素酶Luciferase和抗生物素蛋白avidin的通用细胞U；其中常用细胞X为工具细胞、悬浮细胞或贴壁肿瘤细胞；所述工具细胞为293FT细胞或Jurkat细胞；所述悬浮细胞为U266细胞、RPMI8226细胞、Raji细胞或K562细胞；贴壁肿瘤细胞为MCF-7细胞或MDA-MB-231细胞；④将生物素化处理的蛋白A加入到通用细胞U中，与U细胞膜上的avidin紧密结合，得到单抗原CAR-T毒性指示细胞；生物素化处理的蛋白A为以下细胞的细胞膜靶抗原胞外域部分：CD19、CD20、CD38、CS1、CD30、PDL1、GPC3或Her2肿瘤细胞；将几种不同生物素化处理的蛋白A加入到通用细胞U中，与U细胞膜上的avidin紧密结合，得到多抗原CAR-T毒性指示细胞；生物素化处理的蛋白A为以下细胞的细胞膜靶抗原胞外域部分：CD19、CD20、CD38、CS1、CD30、PDL1、GPC3或Her2肿瘤细胞。优选的，生物素化处理的蛋白A的种类为两种或三种。优选的，常用细胞X为293FT细胞或K562细胞。优选的，生物素化处理的蛋白A为CD19、CD20和CD30细胞的细胞膜靶抗原胞外域部分。优选的一种CAR-T毒性指示细胞的快速构建方法，步骤①中构建序列为SEQNO：1的慢病毒质粒包括以下步骤：⑴全基因合成序列为SEQNO：1的基因片段，设计上下游酶切位点分别为XhoI和BamHI；⑵用XhoI和BamHI双酶切上述基因片段，及pLVX-IRES-Puro质粒，切胶回收后连接；⑶将连本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CAR‑T毒性指示细胞的快速构建方法，其特征在于：包括以下步骤：①构建序列为SEQ NO：1的慢病毒质粒，该慢病毒质粒携带以下外源基因片段：IgK leader、avidin、CD28跨膜区、T2A序列及Luciferase；②慢病毒质粒大提，病毒包装制备得到慢病毒；③慢病毒感染常用细胞X，通过嘌呤霉素筛选获取稳定表达荧光素酶Luciferase和抗生物素蛋白avidin的通用细胞U；其中常用细胞X为工具细胞、悬浮细胞或贴壁肿瘤细胞；所述工具细胞为293FT细胞或Jurkat细胞；所述悬浮细胞为U266细胞、RPMI8226细胞、Raji细胞或K562细胞；贴壁肿瘤细胞为MCF‑7细胞或MDA‑MB‑231细胞；④将一种或几种生物素化处理的蛋白A加入到通用细胞U中，与U细胞膜上的avidin紧密结合，得到CAR‑T毒性指示细胞；生物素化处理的蛋白A为以下细胞的细胞膜靶抗原胞外域部分：CD19、CD20、CD38、CS1、CD30、PDL1、GPC3或Her2肿瘤细胞。

【技术特征摘要】
1.一种CAR-T毒性指示细胞的快速构建方法，其特征在于：包括以下步骤：①构建序列为SEQNO：1的慢病毒质粒，该慢病毒质粒携带以下外源基因片段：IgKleader、avidin、CD28跨膜区、T2A序列及Luciferase；②慢病毒质粒大提，病毒包装制备得到慢病毒；③慢病毒感染常用细胞X，通过嘌呤霉素筛选获取稳定表达荧光素酶Luciferase和抗生物素蛋白avidin的通用细胞U；其中常用细胞X为工具细胞、悬浮细胞或贴壁肿瘤细胞；所述工具细胞为293FT细胞或Jurkat细胞；所述悬浮细胞为U266细胞、RPMI8226细胞、Raji细胞或K562细胞；贴壁肿瘤细胞为MCF-7细胞或MDA-MB-231细胞；④将一种或几种生物素化处理的蛋白A加入到通用细胞U中，与U细胞膜上的avidin紧密结合，得到CAR-T毒性指示细胞；生物素化处理的蛋白A为以下细胞的细胞膜靶抗原胞外域部分：CD19、CD20、CD38、CS1、CD30、PDL1、GPC3或Her2肿瘤细胞。2.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐东起，张文，
申请(专利权)人：山东昂科诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37