一种特异性结合PDL1的核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性结合癌细胞表面PDL1蛋白分子的核酸适配体，其序列如SEQ ID NO：1所示及其在肿瘤检测方面和在促进T细胞对肿瘤细胞杀伤的应用；本发明专利技术的核酸适配体能与肿瘤细胞表面PDL1蛋白特异性结合，亲和力高，单链寡核苷酸只识别与其互补的空间结构，几乎可以完全避免非特异性结合；本发明专利技术的核酸适配体合成成本低，采用SELEX筛选技术可以实现自动化，并且筛选出的核酸适配体经化学合成纯度高，准确度与重复性好。

A DNA Adapter Specifically Binding to PDL1 and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种特异性结合PDL1的核酸适配体及其应用
本专利技术涉及生物
，具体说是一种特异性结合PDL1的核酸适配体及其应用。
技术介绍
程序性死亡受体1(programmeddeath1,PD-1)是T细胞表面的跨膜受体，参与细胞的凋亡，PD1与PDL1(PD-1ligand1,PD-L1)和PDL2(PD-1ligand2,PD-L2)配体相互作用抑制T细胞的增殖，PDL1、DPL2主要表达在抗原递呈细胞中(如DC细胞、巨噬细胞)。研究发现，多种肿瘤细胞高表达PDL1，如多发性骨髓瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌等。肿瘤细胞在多种因子作用下高表达PDL1，与T细胞表面的PD1分子相互作用，抑制T细胞的活化与增殖，进而引起免疫逃逸现象。同时诸多研究证实，癌组织内PDL1蛋白的表达水平的升高明显降低病人的预后与存活率，因此有针对的阻断PD1/PDL1信号通路，能有效增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤和肿瘤的治疗效果。核酸适配体(Aptamer)是一段DNA，通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域，当核酸适配体与目标物质发生特异性结合时，核酸适配体自身的构型会随之发生变化。传统的抗原抗体反应灵敏度和特异性均较好，酶联免疫反应在各种生物分子的探测中发挥着举足轻重的作用，但是蛋白质作为探针分子，容易受pH、温度等环境因素影响而变性且合成价格昂贵，适配体由DNA或RNA构成(主要是DNA)，比蛋白质体积更小，稳定性更好，在未来，适配体有望取代酶联免疫反应，成为各种化学分子探测的有力武器。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种特异性结合PDL1的核酸适配体及其应用。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种特异性结合癌细胞表面PDL1蛋白分子的核酸适配体，其序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还包括一种特异性结合癌细胞表面PDL1蛋白分子的核酸适配体在肿瘤检测方面的应用。本专利技术还包括一种特异性结合癌细胞表面PDL1蛋白分子的核酸适配体在促进T细胞对肿瘤细胞杀伤的应用。优选的应用，所述肿瘤为肺癌、多发性骨髓瘤、肾癌和黑色素瘤。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术的核酸适配体能与肿瘤细胞表面PDL1蛋白特异性结合，亲和力高，单链寡核苷酸只识别与其互补的空间结构，几乎可以完全避免非特异性结合；本专利技术的核酸适配体合成成本低，采用SELEX筛选技术可以实现自动化，并且筛选出的核酸适配体经化学合成纯度高，准确度与重复性好。附图说明图1为特异性结合PDL1的核酸适配体制备过程的流程示意图；图2为流式细胞仪检测各组细胞中PE荧光的强度的示意图；图3为2号aptamer和无意aptamer分别与人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和L363细胞孵育的荧光强度示意图；图4为2号aptamer与RPMI8226细胞和L363细胞的KD值图；图5为显微镜下2号aptamer和对照组aptamer与肾癌组织切片的识别和结合的结果示意图；图6为显微镜下2号aptamer对肺癌细胞和正常肺细胞的表面PDL1蛋白的识别与结合的荧光结果示意图。具体实施方式本专利技术的目的是提供一种特异性结合PDL1的核酸适配体及其应用，通过以下技术方案实现：一种特异性结合癌细胞表面PDL1蛋白分子的核酸适配体，其序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还公开了特异性结合癌细胞表面PDL1蛋白分子的核酸适配体在肿瘤检测方面的应用。本专利技术还公开了特异性结合癌细胞表面PDL1蛋白分子的核酸适配体在促进T细胞对肿瘤细胞杀伤的应用。优选的应用，所述肿瘤为肺癌、多发性骨髓瘤、肾癌和黑色素瘤，多发性骨髓瘤细胞系如RPMI8226、L363等。以下结合具体实施例来对本专利技术作进一步的描述。实施例1一种特异性结合癌细胞表面PDL1蛋白分子的核酸适配体，其序列如SEQIDNO：1所示。实施例21、如图1所示的流程示意图，通过人工合成，建立随机寡核苷酸库，以PDL1蛋白为靶蛋白，选择性分离出同靶蛋白特异性结合的核酸适配体(aptamer)。2、RPMI8226属于PDL1阳性高表达细胞，L363属于阴性低表达细胞。采用消减SELEX筛选出与PDL1蛋白特异性结合的aptamer。消减SELEX筛选三个与PDL1蛋白特异性结合的aptamer，同时设计了一个无意aptamer；无意核酸适配体aptamer序列SEQIDNO：2：acgggccaaatactcattcggtacgaccatgcgaccactgcttacgt；1号核酸适配体aptamer序列SEQIDNO：3：acgggcctcacacatcaataattagccactgcctagagcgttcgcgt；2号核酸适配体aptamer序列SEQIDNO：1：acgggcctctctgaacaaaggtattagacatcatgcgtgcccccagt；3号核酸适配体aptamer序列SEQIDNO：4：acgggcacacatcactcgctgcccgtaagattattgaccaatcacgt；消减SELEX筛选采用以下步骤：⑴浓度10pmol/μL的随机寡核苷酸文库35微升加入到200微升选择性缓冲液内(Tris.HCl50mM；KCl5mM；NaCl100mM；MgCl1mM；pH7.4)，加热99℃5min变性，立即置于0℃5min(加入过量的酵母tRNA与BSA降低背景)；⑵将上述溶液与1*105个RPMI8226细胞37℃混匀孵育30min，1000rpm离心5min，弃去上清，沉淀用选择性缓冲液溶解混匀，再1000rpm离心，如此反复6次；⑶沉淀加入双蒸水，100℃加热10min，10000rpm离心5min，上清抽提核苷酸，20微升缓冲液溶解；⑷将抽提出的核苷酸作为模板进行PCR扩增：①反应体系：模板20微升；10*缓冲液10微升；dNTPs5微升；MgCL23.5微升；上下游引物各5微升；Taq酶5微升；加水至50微升；②反应条件：94℃3min，20个循环：94℃50s，55℃50s，72℃50s，最后72℃5min。⑸PCR产物经苯酚：氯仿抽提出核酸，溶解于缓冲液中；⑹再按照⑴～⑸步骤反复10轮左右，筛选出适量核酸适配体，再经反筛选进一步排除非特异性结合；⑺经10轮筛选后的寡核苷酸文库，以L363细胞作为负性靶细胞进行反筛选，PCR产物99℃加热5min然后立即置于0℃5min；⑻先将1*105个L363细胞离心收集，弃掉上清，用上述液体与细胞沉淀在37℃混匀孵育30min，1000rpm离心5min，收集上清，继续用1*105个L363细胞37℃孵育30min，再1000rpm离心5min，收集上清，如此反复5次；⑼将最后筛选出的核苷酸，用上下游测序引物扩增成dsDNA，回收纯化后连接到T载体，经筛选后随机挑选进行测序；10)最终经11轮正筛与6轮反筛，确定三个aptamer以及合成了一个无意aptamer；3、研究发现，多发性骨髓瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性结合癌细胞表面PDL1蛋白分子的核酸适配体，其特征在于：其序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合癌细胞表面PDL1蛋白分子的核酸适配体，其特征在于：其序列如SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述的特异性结合癌细胞表面PDL1蛋白分子的核酸适配体在肿瘤检测方面的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐东起，刘江，张文，
申请(专利权)人：山东昂科诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37