一种特异性识别副溶血性弧菌的优化适配体序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体，所述适配体的核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。本发明专利技术以副溶血性弧菌为靶标，在SELEX筛选获得的原始序列的基础上，结合剪裁，定向突变，以及LNA取代等手段，获得了能以高亲和力及特异性识别结合副溶血性弧菌的优化适配体序列，并将最优适配体用于样品中副溶血性弧菌的分离富集。本发明专利技术为副溶血性弧菌的检测提供了稳定性良好、亲和力高、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件和应用实例。

An Optimum Adapter Sequence for Specific Recognition of Vibrio parahaemolyticus and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种特异性识别副溶血性弧菌的优化适配体序列及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种特异性识别副溶血性弧菌的优化适配体序列及其应用。
技术介绍
副溶血性弧菌是一种兼性厌氧、嗜盐畏酸不耐热的革兰氏阴性菌，广泛分布于海水、海底沉积物及各类海产品中，如今在淡水养殖鱼类的肠道和鳃中也分离出此菌，是一种广受关注的重要的食源性致病菌，可通过生食或食用加工不彻底的水产品摄入人体内，导致食用者罹患急性肠胃炎，严重的还会引起原发性败血症危及性命。在中国，副溶血性弧菌引发的细菌性食物中毒案例已超过沙门氏菌而中居首位。随着全球变暖，海水温度不断升高，这直接导致副溶血性弧菌的进一步扩散和增殖，给海产品品质和人类健康带来严重威胁。因此，实现食品中副溶血性弧菌准确、快速和灵敏的检测，对于保障食品安全和保护人类健康都有极其重要的意义。常用的检测副溶血性弧菌的方法包括传统平板分离培养和生理生化鉴别法、ELISA法、PCR法、荧光定量PCR法、电化学传感器法等，然而传统的细菌培养和生化鉴定工作量大，操作繁琐且耗时；ELISA法虽有良好的特异性、准确性及较高的灵敏度，但制备特异性抗体的过程仍然繁琐且耗时，制备出的抗体稳定性差，且检测仪器较为昂贵；PCR方法虽然快速、准确，但易受实验操作及周围环境的影响，无法保证其重复性及特异性。适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)对人工合成的随机核苷酸序列文库进行体外筛选后获得的，能够特异性识别结合靶标的一段短的单链核苷酸序列，具有筛选周期短，亲和性高，特异性好，靶标范围广，且成本低廉等显著优点。与抗体相比合成方便，易于修饰，性能稳定，且易于保存。这些特点使得适配体在药物递送，医学诊断，食品安全等领域具有无可匹敌的优势，且已被广泛用作各类生物传感器的识别元件。然而由SELEX过程产生的全长适配体序列含有70-100个核苷酸，其两端均包含一段用于PCR扩增的固定引物区，这部分区域的核苷酸通常并不参与靶标的识别与结合，这种非必需的核苷酸同样可能出现在序列随机区中，它们可能形成各种二级结构从而降低适配体的靶结合构象稳定性，且较长的序列会带来较低的产率和较高的合成成本。因此，在实际使用中，在保留适配体亲和性能的前提下，获得适配体最短序列大有裨益。此外，PCR扩增偏差和由实验操作导致的文库多样性降低也可能影响适配体的结合特性。所以除剪裁外，其他SELEX后优化方法，例如随机或定点突变，锁核酸(LNA)取代，以及多价适配体等也被采用，以提高适配体的性能。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种特异性识别副溶血性弧菌的优化适配体序列及其应用。本专利技术以副溶血性弧菌为靶标，在SELEX筛选获得的原始序列的基础上，结合剪裁，定向突变，以及LNA取代等手段，获得了能以高亲和力及特异性识别结合副溶血性弧菌的优化适配体序列，并将最优适配体用于样品中副溶血性弧菌的分离富集。本专利技术为副溶血性弧菌的检测提供了稳定性良好、亲和力高、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件和应用实例。本专利技术的技术方案如下：一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体，所述适配体的核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体，还包含使用LNA进行末端修饰的适配体。一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体，还包含可提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，或用于形成组合物的亲和配基、巯基修饰基。一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体的应用，用于食品或临床医学中检测副溶血性弧菌。本专利技术的目的是提供一种新的优化的适配体，其合成、处理、表征操作如下：1.适配体的合成由上海生工生物工程技术服务有限公司合成5’端FAM基团标记的适配体，用于亲和特性分析，合成无标记适配体序列用于稳定性分析，合成生物素化适配体用于捕获样品中副溶血性弧菌。2.菌种的处理取对数期(OD600＝0.3)的菌液1mL于离心管中，5000r/min，4℃离心5min，弃去上清，用1×结合缓冲液(1×BB)(50mmol/LTris-HCl(pH7.4)，5mmol/LKCl，100mmol/LNaCl，1mmol/LMgCl2)清洗两遍，去除多余的培养基成分。3.适配体序列的表征(1)适配体亲和力分析将合成的适配体用TE缓冲液配稀释配制成100μM溶液，贮存在-20℃下备用。采用BDFACSCalibur流式细胞分析仪分析适配体的亲和性。取不同体积的100μM适配体加入500μLBB缓冲液中稀释为不同的浓度梯度(0，25，50，100，125，200nmol/L)，于95℃变性8min，立即冰浴冷却8min。将适配体溶液加入处理好的副溶血性弧菌中，在37℃下缓慢振荡孵育45min。然后用BB缓冲液清洗，重悬于500μLBB缓冲液后进行流式细胞分析。流式细胞分析中先调节空白样品(未添加适配体)的荧光强度，然后在相同参数下测定样品的前向散射、侧向散射和荧光强度。样品的荧光强度百分比表征亲和性大小，利用GraphPadPrism5软件计算各适配体的解离常数Kd值并绘制其饱和结合曲线。(2)适配体特异性分析将100pmol适配体溶液分别与副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、福氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、和蜡样芽孢杆菌在500μLBB缓冲液中于37℃缓慢振荡孵育45min，然后用BB缓冲液清洗，重悬于500μLBB缓冲液中，避光混匀后进行流式细胞分析。(3)适配体稳定性分析候选适配体95℃变性8min，立即冰浴8min，并加入100μL(0.5％)BSA以降低非特异性结合(600μL体系)，然后将这些序列与副溶血性弧菌(108cfu/mL)于室温下分别孵育240，360，480，600，720，840min，往适配体与目标菌体的复合物中加入100μL的1×PCR缓冲液于95℃变性8min，立即冰浴8min，通过热变性将结合上的适配体从目标菌体上解离下来，8000r/min，4℃离心5min，收集上清。所有样品同时进行2％琼脂糖凝胶电泳，观察谱带强度降至空白对照的一半的孵育时间，将此时间定义为其半衰期。本专利技术方法以副溶血性弧菌为靶标，在SELEX筛选获得的原始适配体序列的基础上，利用剪裁和定向突变获得1条与靶细胞高亲和性、高特异性结合的适配体A4，在其3’末端使用LNA取代三个核苷酸后，可在保持其亲和特性的同时，获得理想的稳定性。在此基础上，将该适配体序列结合磁性纳米颗粒(MNP)，可特异性分离富集样品中的副溶血性弧菌。该适配体是副溶血性弧菌的新型识别元件，具有灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的优势，并能应用于多种检测方法的构建。本专利技术有益的技术效果在于：(1)本专利技术适配体与抗体相比，适配体可在体外筛选，筛选周期短，合成方便，易标记各种功能基团和报告分子，性质稳定，可长期保存使用；(2)本专利技术适配体序列是基于原始序列的二级结构，通过剪裁，定向突变，以及LNA取代等手段获得的亲和力和特异性均较强的适配体序列，能够特异识别副溶血性弧菌；(3)与筛选获得的原始副溶血性弧菌适配体相比，本专利技术适配体序列具有理想的亲和力，良好的特异性，更强的稳定性，更高的产率，以及较低的合成成本，能够更本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。2.根据权利要求1所述的适配体，其特征在于，还包含使用LNA进行末端取代的适配体。3.根据权利要求1所述的适配体，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，孙羽菡，段诺，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32