抗肿瘤NK细胞的制备方法及其细胞与应用技术

本发明专利技术公开一种转基因NK细胞的制备方法，步骤：(a)将趋化因子受体基因CCR7基因和CXCR4基因连接到慢病毒载体PHS‑BVC‑LW238，形成重组基因工程载体；(b)将重组基因工程载体转染所述NK92细胞，得到转基因NK细胞。该转基因NK细胞能够良好地抑制肿瘤的生长。

Preparation and Cell Application of Anti-Tumor NK Cells

【技术实现步骤摘要】
抗肿瘤NK细胞的制备方法及其细胞与应用
本专利技术属于医学领域，涉及瘤体趋化的新型高效抗肿瘤NK细胞及其研制。
技术介绍
近年来，免疫治疗在肿瘤治疗领域中的应用越来越广，2014、2015年连续两年被评为年度最重要的科学突破领域，其成就超越了传统化疗、放疗和手术，成为癌症治疗的新手段。包括DC、CAR-T、NK细胞和免疫检查点单抗等的肿瘤免疫治疗研究越来越深入。目前认为，细胞免疫治疗针对实体肿瘤的疗效的制约瓶颈有三：肿瘤缺乏理想的靶点、瘤体组织浸润的活化免疫细胞少和肿瘤微环境免疫抑制。NK细胞具有强大的天然抗肿瘤和抗感染免疫作用，其抗肿瘤活性无需肿瘤细胞抗原(靶点)即可识别并攻击肿瘤细胞，回避了实体肿瘤细胞缺乏理想的靶点这一障碍。NK细胞具有抗肿瘤、抗感染和调节机体免疫应答等功能，NK细胞不需要特异抗原的刺激，在免疫治疗领域有较好的前景。早期利用NK细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)进行免疫治疗。肿瘤细胞已进化出多种机制来逃避NK细胞识别，其中包括MHCI类分子和NK抑制性受体配体的表达。为了克服肿瘤细胞对NK细胞介导的溶解性的抵抗，提高对肿瘤识别能力，嵌合受体被广泛研究。其原理：引入嵌合抗原受体将极大避免将抑制性信号传递到NK细胞内，从而增强NK细胞抗肿瘤能力。目前，常用基因修饰的方法使NK细胞表达肿瘤相关抗原(TAA)特异性的嵌合受体，一旦接触抗原，嵌合受体信号即可激活NK细胞。嵌合受体必须引入信号转导结构域才能有效增强NK细胞功能，包括细胞毒作用和细胞因子的释放，最常用的是来自TCR-CD3复合物的信号结构域。近年来，NK细胞因其独特优势和作用机制作为针对肿瘤的免疫治疗越来越受到重视[1]，并成为治疗癌症的新型有效手段。NK细胞在循环中的相对较短的寿命避免了许多基于T细胞的免疫疗法中常见的危险细胞因子风暴[2]，因而过继输注NK细胞的脱靶毒性很小。NK细胞的独特优点是它们可以在没有特异性抗原识别的情况下杀死肿瘤细胞，已在多种肿瘤治疗上取得一定的效果，如血液肿瘤和黑色素瘤等[3-5]。并且NK细胞的过继输注已成功应用于白血病和其他血液肿瘤患者[6-8]。然而，其在包括结肠癌在内的其他实体瘤中的治疗效果并不理想[9,10]。多项研究报道影响NK细胞过继免疫治疗成败的关键在于迁移到肿瘤部位的NK细胞数量[9,2,1,6]。目前针对NK细胞肿瘤杀伤的研究主要集中在促进其在体内生存、体内平衡增殖等方面；而促进NK细胞趋化、聚集到肿瘤部位是非常重要的一个环节，目前尚未见研究报道。这种研究是临床NK细胞免疫治疗新兴的重要方向[2,11]。最近的研究表明，细胞因子激活和体外扩增的NK细胞缺乏或表达低水平的趋化因子受体，这意味着NK细胞上趋化因子受体的表达量可能对NK细胞向瘤体趋化这一过程至关重要。趋化因子和趋化因子受体在淋巴细胞向肿瘤迁移中起着重要作用[12]。将NK细胞有效运输到肿瘤部位是癌症免疫治疗成功的关键步骤。通过对NK细胞免疫治疗进行临床I期试验，ChildsRW等发现一种影响实体瘤患者NK细胞输注临床结果的重要制约因素是NK细胞未能足量迁移至肿瘤部位[13]。免疫细胞可以通过细胞表面的趋化因子受体与肿瘤分泌的趋化因子相互作用被引导进入肿瘤[12]。近年来这些特征在肿瘤免疫治疗种得到越来越多的关注。先前已有给予外源性细胞因子，或通过转基因提高趋化因子表达水平，从而促进NK细胞增殖而提高瘤体内NK细胞数量的报道[13]，这种方案的缺点是外源性细胞因子的全身副作用大，难以控制细胞因子表达量，直接作用于NK细胞的浓度也不高。此外，细胞因子转基因修饰方式受到主要组织相容性复合基因MHC分子限制性的控制，使得其应用亦受到限制。而通过基因修饰NK细胞表面的趋化因子受体，既可以避免转基因修饰细胞因子不足，又可以使免疫细胞更多的向肿瘤微环境浸润，增强抑瘤作用。NK细胞在机体抗肿瘤中发挥重要作用，采用体外扩增方法获得高数量、高纯度NK细胞，是近年研究NK细胞过继免疫治疗的热点。随扩增方法进步，NK细胞活性、纯度提高，为NK细胞成为肿瘤过继免疫治疗提供重要平台。目前NK细胞过继免疫治疗分为两类：自体NK细胞治疗和异体NK细胞治疗。Rosenberg等应用IL-2诱导患者PBMC获得LAK细胞，配合大剂量IL-2对肾癌、黑色素瘤等患者进行治疗，获得20-30％肿瘤缓解率，但大剂量IL-2带来很大不良反应。随着扩增技术提高，IL-2用量减少而NK细胞活性、纯度提高。从多发性骨髓瘤患者外周血提取并培养扩增出NK细胞，再用其体外杀伤患者自体骨髓瘤细胞，杀伤效果明显，表明自体NK细胞有望成为治疗骨髓瘤新手段。杨孟寅等提取脑胶质瘤患者外周单个核细胞，经体外扩增培养出NK细胞，治疗恶性复发性脑胶质瘤，疗效显著。虽然多项研究发现自体NK细胞治疗肿瘤获得缓解，仍有一部分患者无法获益，以下原因可能影响自体NK细胞治疗疗效：①NK细胞只能杀伤缺乏及配型不一致的HLA分子肿瘤细胞，对表达HLA分子的肿瘤细胞没有杀伤作用。如果患者肿瘤细胞表达HLA分子。那么NK细胞表面的抑制性受体将发挥主要作用，患者自体激活的NK细胞将不能起到杀伤作用。②最近研究发现肿瘤可能导致NK细胞数量减少，即患者外周血中能刺激转化为NK细胞的效应细胞数量较少，同时肿瘤患者NK细胞的功能与正常人相比有不同程度的损害，可能导致扩增出的自体NK细胞功能低下。基于自体NK细胞免疫治疗存在的缺点以及技术上的难度，许多学者试图建立应用异体NK细胞用于肿瘤生物治疗。包括正常NK细胞来源的NK细胞系NK3.3和恶性变细胞来源的NK细胞系YT，NK-92，NKL，HANK-1，NK—YS，KHYG·1及NKG。在上述NK细胞系中，NK-92是唯一进入临床研究的细胞系，其对不同来源肿瘤细胞系，如白血病、乳腺癌等都表现出高效的杀伤活性。其表面表达大量活化受体，如NKp30、NKp46、NKG2D、NKG2E、CD28；抑制受体的表达极少，只有NKGA/B和低水平的K1112DIA与ILT-2.缺乏大多数正常NK细胞克隆表达的KIRs，却保留穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒作用。近年来Cheng等研究发现的NKG细胞系为CD56brightNK细胞，高表达粘附因子、活化性受体和细胞溶解相关的受体及分子，其杀伤肿瘤细胞的能力优于NK-92，NKL及YT，可能会成为肿瘤患者过继免疫治疗的NK细胞系。Barkholt等在应用体外扩增的异体NK细胞治疗恶性肿瘤的I期临床试验研究表明，异体NK细胞治疗恶性肿瘤无毒副作用以及移植物抗宿主反应，提示NK细胞可能成为恶性肿瘤治疗的新路径。但是异体NK细胞治疗肿瘤也存在一系列问题，如供者NK细胞在受者体内存活时间长短，会不会被患者自身的获得性免疫细胞消灭，再者异体NK细胞输注的不良反应有哪些，临床应用是否安全等，这些仍需进一步的研究。目前国外有通过强化T淋巴细胞趋化过程而达到增加瘤体局部的T细胞数量的研究报道；诸多研究证明，趋化因子与NK细胞受体结合后不仅产生趋化过程，还可激活NK自身的对肿瘤细胞的杀伤活性。嵌合受体表达可提高NK细胞(CAR-NK细胞)是正在兴起的新型基因工程抗肿瘤NK细胞。原理：引入嵌合抗原受体将会大大避免将抑制性信号传递到NK细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因NK细胞的制备方法，所述制备方法为：将趋化因子受体基因转到NK细胞中，得到能够过表达所述趋化因子受体基因的所述转基因NK细胞。

【技术特征摘要】
1.一种转基因NK细胞的制备方法，所述制备方法为：将趋化因子受体基因转到NK细胞中，得到能够过表达所述趋化因子受体基因的所述转基因NK细胞。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述趋化因子受体基因是NK细胞的趋化因子受体基因；优选，所述趋化因子受体基因为：人CCR7基因和/或人CXCR4基因；优选，所述人CCR7基因的GenBank号为：NM_001301714.1；所述人CXCR4基因的GenBank号为：NM_001008540.2；优选，所述NK细胞是异体NK细胞；优选，所述NK细胞是NK92细胞；优选，所述趋化因子受体基因在所述抗肿瘤NK细胞中稳定过表达。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(a)将所述趋化因子受体基因连接到基因工程载体上，形成重组基因工程载体；(b)将所述重组基因工程载体转化或转染所述NK细胞，得到所述转基因NK细胞；优选，所述基因工程载体是慢病毒载体，更优选，所述基因工程载体是慢病毒载体PHS-BVC-LW238。4.一种转基因NK细胞，所述转基因NK细胞是如权利要求1-3中任一项所述的制备方法制备得到的所述转基因NK细胞。5.一种转基因NK细胞，所述转基因NK细胞能够表达趋化因子受体基因；优选，所述趋化因子受...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄常新，杨丽丽，李永强，王聪洁，张嗣玉，高岚岚，葛钻敏，苏萌，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33