稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，属于生物技术领域。该重组质粒是以慢病毒表达载体pLV‑sfGFP[2A]Puro为基础构建的，并整合有CD163编码基因。本发明专利技术提供的这种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，采用特殊的慢病毒系统将CD163基因整合到永生化的PAM细胞染色体上，使得永生化的PAM细胞系能够永久性地稳定表达CD163蛋白，而使细胞易受PRRSV感染。PRRSV在该细胞系(mPAM‑CD163)上的毒价可以高达10

Recombinant plasmid expressing stable CD163 receptor protein, recombinant lentivirus and porcine alveolar macrophage system and construction method thereof

【技术实现步骤摘要】
稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)在上世纪90年代初出现在欧洲和美国，此后成为全球养猪业的一个严重问题。PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种持续的、严重的疾病，其特征是不同年龄段的猪呼吸道问题、生长性能差以及怀孕母猪生殖障碍。由于该病持续的亚临床感染及病毒的高度变异性和抗体反应不能完全免于病毒再感染和再出现，控制该疾病的措施变得复杂。目前，PRRSV几乎在全球每一个养猪国家都存在，并且呈现出一种严峻的流行态势，成为危害全球养猪业最为严重的疾病之一。PRRSV的增殖具有非常严格的宿主嗜性。原代猪肺泡巨噬细胞(pPAM)和血液单核细胞是对PRRSV感染敏感的猪源细胞。PRRSV主要通过呼吸道和生殖道粘膜侵入动物机体，通过作用于pPAM在动物肺部引起强烈的炎症反应，继而在猪体出现典型的呼吸道症状。随着PRRSV的大量复制，在病毒感染后期，PAM细胞出现大量破裂溶解，PRRSV随着血液和淋巴液循环到达体内各组织器官。PRRSV可以导致宿主机体的持续性免疫抑制。另外，该病毒极易发生变异，容易出现免疫逃避、病毒持续感染的现象，并且容易诱导广范围的继发感染，使其他的病原微生物侵入机体。然而，由于pPAM细胞不仅难以获得，而且不能方便地保存或长期使用。同时，在一些PRRSV流行国家(例如中国)，很难获得源自PRRS抗原和抗体双阴性猪的pPAM。虽然已经有报道了永生化的PAM细胞系(mPAM)，但由于该细胞系不能表达PRRSV感染所需的受体蛋白CD163，使得该细胞系不能被PRRSV感染。因此，这就严重制约了感染PAM与宿主免疫细胞之间作用机制等方面的研究，进而难以有效控制PRRSV。另一方面，当前PRRSV疫苗工业化生产中采用的细胞是MARC-145细胞，高致病性PRRSV(HP-PRRSV)在该细胞上的毒价较低，一般是104-106TCID50/0.1mL，导致疫苗的生产效率还有较大的提升空间。鉴于此，本申请提供一种能够稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，为研究PRRSV感染PAM与宿主免疫细胞之间的相互作用等提供有力工具，也为显著提升PRRSV疫苗的工业化生产效率提供了一种更加高效、实用的细胞。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种用于CD163受体表达的重组质粒及其构建方法，具体如下：一种用于CD163受体表达的重组质粒，重组质粒是以慢病毒表达载体pLV-sfGFP[2A]Puro为基础构建的，并整合有CD-163编码基因。一种上述重组质粒的构建方法，其包括：对CD163基因进行PCR扩增，并将CD163基因克隆至pEASY-T1载体中，得到载体pEASY-T1-CD163；从载体pEASY-T1-CD163上将CD163基因克隆至慢病毒表达载体pLV-sfGFP(2A)Puro中，用限制性内切酶XbaI和XhoI分别对pEASY-T1-CD163和pLV-sfGFP(2A)Puro进行双酶切；用DNA连接酶将酶切得到的CD163基因产物和pLV-sfGFP(2A)Puro产物进行连接，得到重组质粒pLV-EGFP-CD163。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述对CD163基因进行PCR扩增的引物对为：CD163-F：GCTCTAGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC；CD163-R：CCCTCGAGTCATTGTACTTCAGAGTGGTCTCCTG。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述对CD163基因进行PCR扩增的条件为：92-96℃下预变性6-8min；93-95℃下变形25-35s,50-60℃下退火40-50s,67-77℃下延伸50-70s,共30-40个循环；再于67-77℃下延伸8-12min。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述CD163基因来源于原代猪肺泡巨噬细胞。第二方面，本专利技术提供一种用于CD163受体表达的重组慢病毒，具体如下：一种用于CD163受体表达的重组慢病毒，其通过将上述重组质粒转染哺乳细胞所得。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述哺乳细胞为Lenti-X293T细胞系。第三方面，本专利技术提供一种稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，具体如下：一种稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系，其通过将上述重组慢病毒转导至永生化的猪肺泡巨噬细胞系中并进行筛选得到。一种稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系的构建方法，其包括：培养永生化的猪肺泡巨噬细胞系3D4/21至细胞密度达到70-80％；再与权利要求6或7的重组慢病毒混合，于35-39℃、4-7％CO2下培育6-8h；采用含有嘌呤霉素的培养基培养1-2周，每3-4d更换新的含有嘌呤霉素的培养基，直至出现单克隆细胞；挑选单克隆细胞，采用有限稀释法进行筛选。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述嘌呤霉素的浓度为最佳筛选浓度，其通过下述方法获得：培养永生化的猪肺泡巨噬细胞系3D4/21至细胞密度达到70-80％，换成含有不同浓度的嘌呤霉素的培养基，在3-5d内能杀死所有细胞的最小嘌呤霉素的浓度为最佳筛选浓度。与现有技术相比，本专利技术的有益效果例如包括：本专利技术提供的这种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，采用特殊的慢病毒系统将CD163基因整合到永生化的PAM细胞染色体上，使得永生化的PAM细胞系能够永久性地稳定表达CD163蛋白，而易受PRRSV感染，为研究PRRSV感染PAM与宿主免疫细胞之间的相互作用及其他相关研究提供有力工具，也可为显著提升PRRSV疫苗的工业化生产效率提供一种更加高效实用的细胞。本申请中采用的慢病毒表达载体为pLV-sfGFP[2A]Puro，该载体是基于HIV1的慢病毒基因过表达载体，采用CMV启动子启动目的基因的表达。通过将sfGFP基因放在不同的启动子，该载体保留了荧光标签在病毒包装检测中的便利性，也避免了融合标签蛋白对目的基因功能产生影响，因此通过荧光显微镜即可直观化的对后续重组阳性猪肺泡巨噬细胞系进行筛选，减少误差和筛选周期。此外，pLV-sfGFP[2A]Puro载体包含了生产慢病毒所必须的病毒原件以及提高病毒滴度及基因表达效率的原件，该载体结构紧凑，能够产生高滴度病毒，且对导入的CD163基因片段的融合度高。基于以上操作，专利技术人用高致病性HP-PRRSV毒株JXA1感染所获得的重组猪肺泡巨噬细胞系(命名为：mPAM-CD163)，能产生高滴度的子代病毒，其病毒核酸拷贝数高于109copies/mL、对该细胞的半数感染量(TCID50)则高达106.9/0.1mL；该细胞系能够稳定传代至少100代以上。同时，该mPAM-CD163细胞系与pPAM细胞相比显示了极其相似的病毒复制和细胞因子分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于CD163受体表达的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是以慢病毒表达载体pLV‑sfGFP[2A]Puro为基础构建的，并整合有CD‑163编码基因。

【技术特征摘要】
1.一种用于CD163受体表达的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是以慢病毒表达载体pLV-sfGFP[2A]Puro为基础构建的，并整合有CD-163编码基因。2.一种根据权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，其包括：对CD163基因进行PCR扩增，并将CD163基因克隆至pEASY-T1载体中，得到载体pEASY-T1-CD163；从所述载体pEASY-T1-CD163上将CD163基因克隆至所述慢病毒表达载体pLV-sfGFP(2A)Puro中，用限制性内切酶XbaI和XhoI分别对所述pEASY-T1-CD163和所述pLV-sfGFP(2A)Puro进行双酶切；用DNA连接酶将酶切得到的CD163基因产物和pLV-sfGFP(2A)Puro产物进行连接，得到重组质粒pLV-EGFP-CD163。3.根据权利要求2所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，对所述CD163基因进行PCR扩增的引物对为：CD163-F：GCTCTAGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC；CD163-R：CCCTCGAGTCATTGTACTTCAGAGTGGTCTCCTG。4.根据权利要求3所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，对所述CD163基因进行PCR扩增的条件为：92-96℃下预变性6-8min；93-95℃下变形25-35s,50-60℃下退火40-50s,67-77℃下延...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭军，徐煜琳，庞恒，李传刚，王亭亭，吴家强，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37