快速鉴定抗CMV辣椒的种特异性引物对、试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于基因鉴定技术领域，公开了一种快速鉴定抗CMV辣椒的种特异性引物对、试剂盒及方法，快速鉴定抗CMV辣椒的试剂盒包括：盒体、反应板、DNA提取槽、扩增槽、水浴槽、加样孔、观察孔；盒体底部胶接有反应板，反应板上开凿有DNA提取槽和扩增槽，DNA提取槽和扩增槽上部分别对应有加样孔，扩增槽侧面镶嵌有透明玻璃孔为观察孔；DNA提取槽和扩增槽下方分别卡接有水浴槽。本发明专利技术将DNA提取试剂盒与扩增检测试剂盒进行综合利用，避免了在进行检测时还需要用特殊的设备进行DNA提取，简化了实验反应前的准备工作，采用的显色染料简单，使用肉眼即可进行观察。

Rapid identification of species-specific primer pairs, kits and methods for CMV-resistant pepper

【技术实现步骤摘要】
快速鉴定抗CMV辣椒的种特异性引物对、试剂盒及方法
本专利技术属于基因鉴定
，尤其涉及快速鉴定抗CMV辣椒的种特异性引物对、试剂盒及方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：CMV即黄瓜花叶病毒，是一种非常严重的病毒病害，病毒可以到达除生长点以外的任何部位，病毒的生命活动很特殊，对细胞有绝对的依存性。其存在形式有二:一是细胞外形式，一是细胞内形式。存在于细胞外环境时，则不显复制活性，但保持感染活性，是病毒体或病毒颗粒形式。进入细胞内则解体释放出核酸分子(DNA)，借细胞内环境的条件以独特的生命活动体系进行复制，是为核酸分子形式。病毒以颗粒形式存在于细胞之外，此时，只具感染性。一旦感染细胞病毒解体而释放出核酸基因组，然后才能进行复制和增殖，并产生新的子代病毒。有的病毒基因组整合于细胞基因组，随细胞的繁殖而增殖，此时病毒即以基因形式增殖，而不是以颗粒形式增殖，这是病毒潜伏感染的一种方式。因此及时的病毒进行检测，提前做好预防，以防病毒的传播是十分有必要的。目前，植物中抗CMV的检测方法操作较繁琐，灵敏度较低，难以适用于大量的检测。通常的有机荧光化合物在稀溶液中具有很强的荧光，在一定的浓度范围内荧光强度与荧光物质的浓度呈正比，但是对于较浓的溶液，由于分子间电子振动的相互作用导致了非辐射能量转换，平面荧光生色团之间作用变强，形成了导致荧光淬灭的激基缔合物，出现了荧光减弱或者消失的现象，使得其在固态或聚集状态下的发光效率与其低浓度的稀溶液相比呈数量级的下降，极大地限制了有机荧光化合物作为有机发光材料的应用范围，成为有机发光材料在固态发光器件应用中面临的重要问题。想要突破这种瓶颈，研发出高效稳定的新型有机发光材料，就要克服聚集诱导荧光淬灭的问题。花菁类染料的摩尔吸收系数大，荧光发射波长范围宽，一般在600～1000nm的近红外区，在用于生物体内物质的检测时，可以极大的降低生物体内物质的自吸收和自发荧光的干扰，提高检测的灵敏度和选择性，同时还能够减少对生命体的损伤，有利于实现活体检测。近红外荧光染料可以作为一种安全、非侵入性的成像荧光探针广泛应用于医学和生物学领域。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)目前对植物中抗CMV的检测方法操作较繁琐，灵敏度较低，难以适用于大量的检测。(2)目前对抗CMV的检测中用到的DNA模板需要使用单独的设备进行提取，前期的准备工作较繁琐。(3)目前对抗CMV的检测没有明确的引物对，不同的检测方法用到的引物对不同，检测结果难以进行鉴定。抗CMV辣椒有机荧光成分存在聚集诱导荧光淬灭的问题。检测结果难以进行观察。造成结果不准确。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种快速鉴定抗CMV辣椒的种特异性引物对、试剂盒及方法。本专利技术是这样实现的，一种快速鉴定抗CMV辣椒的方法，所述快快速鉴定抗CMV辣椒的方法包括：步骤一：取待检测辣椒叶进行预处理：清洗，消毒，贴标签记录时间、品种、取样地点；步骤二：称取预处理后的辣椒叶片0.1～0.3g，于研钵中研磨粉碎，剔除脉络，用镊子将其放置于试剂盒DNA提取槽中，静置2min，进行DNA提取；步骤三：将提取的DNA作为模板，利用移液枪从试剂盒的吸取孔中吸取1.5μLDNA模板迅速放置于试剂盒扩增槽中进行扩增，反应0.5h～1h；步骤四：反应结束后，从观察孔用肉眼观察扩增槽中的颜色变化，显绿色判断为阳性反应，显橙色判断为阴性反应。进一步，所述步骤三中，扩增过程为：95℃预变性3min；95℃变性30s；60℃退火30s；70℃延伸1min30s30个循环；72℃延伸4min；4℃终止。进一步，步骤四检测扩增槽中的颜色变化中，通过聚集诱导发光效应的花菁荧光物质进行增强显色效应，显绿色判断为阳性反应，显橙色判断为阴性反应。进一步，聚集诱导发光效应的花菁荧光物质的制备方法包括：步骤一，TPE-CHO和噻唑盐反应，投料摩尔比为1:2.5，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺DMF，反应温度室温，反应时间1h～5h；步骤二，取步骤一所得的产物，加入乙醚并离心，取上清液用乙醚析出固体，弃去上清；向所得固体中加入乙酸乙酯并震荡，有固体溶解，弃去上清。本专利技术的另一目的在于提供一种所述快速鉴定抗CMV辣椒的方法使用的种特异性引物对，所述种特异性引物对为：上游引物CMV1F的核苷酸序列为5’-CCTCACCGGTACTGGTTTATCAGT-3’；下游引物CMV1R的核苷酸序列为5’-CGCCGAAAGATCGTACAACA-3’。本专利技术的另一目的在于提供一种所述快速鉴定抗CMV辣椒的方法使用的试剂盒，所述试剂盒包括：盒体、反应板、DNA提取槽、扩增槽、水浴槽、加样孔、观察孔；盒体底部胶接有反应板，反应板上开凿有DNA提取槽和扩增槽，DNA提取槽和扩增槽上部分别对应有加样孔，扩增槽侧面镶嵌有透明玻璃孔为观察孔；DNA提取槽和扩增槽下方分别卡接有水浴槽。进一步，所述DNA提取槽中盛放有DNA快速提取液，DNA快速提取液由2％的十六烷基三甲基溴化铵、2％聚乙烯吡咯烷酮、1MTris-HClpH7.5构成。进一步，所述扩增槽中盛放有反应缓冲液10μL、酶溶液0.8μL、引物对5μL、显色剂1μL、DNA模板1.5μL及去离子水5μL。进一步，所述反应缓冲溶液为用蒸馏水配制的内含1％聚乙二醇4000、0.5‰硫柳汞钠以及1‰吐温-20的pH＝7.4，0.07M的磷酸盐缓冲液；酶溶液为酶活为1U的TaqDNA聚合酶和浓度为2.0mmol/L的Mg2+。进一步，所述显色剂为钙黄绿素荧光染料。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术将DNA提取试剂盒与扩增检测试剂盒进行综合利用，避免了在进行检测时还需要用特殊的设备进行DNA提取，简化了实验反应前的准备工作，采用的显色染料简单，使用肉眼即可进行观察。本专利技术提供了检测抗CMV的引物对，通过将提取的DNA滴加入扩增槽中，将引物对与DNA模板通过显色剂进行显色反应即可完成，便于操作且灵敏度较高，大大提高了抗CMV的检测速度。本专利技术融合TPE和花菁结构单元的分子探针，合成过程相对简单快速，在抗体检测领域具有巨大的应用潜力。本专利技术合成的TPE化合物具有发光性能优良、合成简便、易功能化等优点，对活细胞毒性较小，具有活细胞膜通透性，可用于抗CMV荧光成像。附图说明图1是本专利技术实施例提供的快速鉴定抗CMV辣椒的鉴定方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的快速鉴定抗CMV辣椒的试剂盒结构示意图。图3是本专利技术实施例提供的反应板结构示意图。图4是本专利技术实施例提供的抗CMV辣椒的鉴定结果示意图。图中：1、盒体；2、反应板；3、加样孔；4、观察孔；5、水浴槽；6、DNA提取槽；7、扩增槽。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理做详细描述。如图1所示，本专利技术实施例提供的快速鉴定抗CMV辣椒的鉴定方法，具体包括以下步骤：S101：取待检测辣椒叶进行预处理：清洗，消毒，贴标签记录时间、品种、取样地点。S102：称取预处理后的辣椒叶片0.1～0.3g，于研钵中研磨粉碎，剔除脉络，用镊子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速鉴定抗CMV辣椒的方法，其特征在于，所述快速鉴定抗CMV辣椒的方法包括：步骤一：取待检测辣椒叶进行预处理：清洗，消毒，贴标签记录时间、品种、取样地点；步骤二：称取预处理后的辣椒叶片0.1～0.3g，于研钵中研磨粉碎，剔除脉络，用镊子将其放置于试剂盒DNA提取槽中，静置2min，进行DNA提取；步骤三：将提取的DNA作为模板，利用移液枪从试剂盒的吸取孔中吸取1.5μL DNA模板迅速放置于试剂盒扩增槽中进行扩增，反应0.5h～1h；步骤四：反应结束后，检测扩增槽中的颜色变化，显绿色判断为阳性反应，显橙色判断为阴性反应。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定抗CMV辣椒的方法，其特征在于，所述快速鉴定抗CMV辣椒的方法包括：步骤一：取待检测辣椒叶进行预处理：清洗，消毒，贴标签记录时间、品种、取样地点；步骤二：称取预处理后的辣椒叶片0.1～0.3g，于研钵中研磨粉碎，剔除脉络，用镊子将其放置于试剂盒DNA提取槽中，静置2min，进行DNA提取；步骤三：将提取的DNA作为模板，利用移液枪从试剂盒的吸取孔中吸取1.5μLDNA模板迅速放置于试剂盒扩增槽中进行扩增，反应0.5h～1h；步骤四：反应结束后，检测扩增槽中的颜色变化，显绿色判断为阳性反应，显橙色判断为阴性反应。2.如权利要求1所述的快速鉴定抗CMV辣椒的方法，其特征在于，所述步骤三中，扩增过程为：95℃预变性3min；95℃变性30s；60℃退火30s；70℃延伸1min30s30个循环；72℃延伸4min；4℃终止。3.如权利要求1所述的快速鉴定抗CMV辣椒的方法，其特征在于，步骤四检测扩增槽中的颜色变化中，通过聚集诱导发光效应的花菁荧光物质进行增强显色效应，显绿色判断为阳性反应，显橙色判断为阴性反应。4.如权利要求3所述的快速鉴定抗CMV辣椒的方法，其特征在于，聚集诱导发光效应的花菁荧光物质的制备方法包括：步骤一，TPE-CHO和噻唑盐反应，投料摩尔比为1:2.5，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺DMF，反应温度室温，反应时间1h～5h；步骤二，取步骤一所得的产物，加入乙醚并离心，取上清液用乙醚析出固体，弃去上清；向所得固体中加入乙酸乙酯并震荡，有固体溶解，弃...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗阿东，蔡秋，吴山楠，王艳，
申请(专利权)人：贵州出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心贵州国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：贵州,52