一种辣椒及制品中转基因成分检测及应用方法技术

本发明专利技术属于食品安全技术领域，公开了一种辣椒及制品中转基因成分检测及应用方法，辣椒及制品中转基因成分检测方法为：样品前处理；选用改良后的核酸提取方法；针对辣椒转基因基团设计特异性的荧光PCR引物、探针，建立并优化反应条件，达到最佳反应设置；应用方法为：对以上建立的实时荧光PCR检测方法进行方法验证，同时对检测的特异性、准确性、灵敏度进行验证；通过对收集的样品进行应用检测的结果，对市场上的辣椒及制品进行转基因调查。本发明专利技术针对辣椒及制品的核酸提取，建立了最大核酸提取效率的方法，并且对辣椒及制品建立了一种通用性强、检测快速、准确的实时荧光PCR方法。

【技术实现步骤摘要】
一种辣椒及制品中转基因成分检测及应用方法
本专利技术属于食品安全
，尤其涉及一种辣椒及制品中转基因成分检测及应用方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：随着辣椒消费需求的不断增加及初加工、深加工行业的不断发展，国际加工辣椒需求量的增加，辣椒的产量和品质倍受关注，然而病虫害及不良环境因素严重影响了辣椒产量和品质的提高。较常规育种而言，转基因育种技术有着育种周期短、克服远缘杂交不亲和等优点。但是由于对转基因作物及其产品的安全性存在争议，对人类健康和生态环境的潜在威胁受到国际社会和广大民众的广泛关注，同时受国际政治和经济因素的影响，许多国家出台了严格的管理法规，目前全球已有65个国家和地区对转基因产品实行强制性标识管理制度，少部分国家或地区实行自愿标识制度。欧盟、澳大利亚、俄罗斯、日本、韩国等国家和地区的转基因产品标签制度，要求食品中转基因成分含量超过1％或5％的必须实施标签，而欧盟的要求阈值更加严格，由原来的1％(1997年)提高到0.9％(2003年)。在这些国家和地区对转基因的管理法规越来越严格的形势下，我国作为辣椒的种植、生产、出口大国，容易受到严重的影响，尤其是在全国辣椒及制品出口额逐年上升的良好态势下，转基因的风险系数不断提高。目前已出现部分出口产品因转基因问题而出现拒收、退运等情况，因此，对辣椒及制品进行转基因风险分析势在必行。由于转基因作物及其产品的安全性成为全球范围内的关注热点，对转基因成分的检测越来越受到重视。DNA是遗传信息的载体，提取高质量的DNA分子是植物基因组学及转基因检测研究的基础，通常要求所提取的DNA分子应具有较高的纯度，且无断裂、降解现象，提取过程尽量少使用有毒的化学药品以保证下游工作的进行。由于辣椒制品成分复杂，辣椒中富含的酚类化合物、蛋白质、多糖等物质会抑制DNA提取质量；同时还含有盐、糖、油、色素等食品添加剂，此外，加工过程中的煎、炸、煮、烤等工艺也会使原料中的DNA会受到不同程度的损坏。因此，从加工食品中提取DNA比从原材料中提取DNA相对的困难。所以，目前国内外对辣椒及制品中转基因成分检测技术研究较少，检测技术无法跟进辣椒转基因技术的发展，既不利于转基因物种监管，也不利于避免国际贸易中设置的技术壁垒。因此，对辣椒及制品中转基因成分检测方法的研究，建立快速、准确的检测技术就显得尤为迫切。综上所述，现有技术存在的问题是：由于辣椒制品成分复杂，辣椒中富含的酚类化合物、蛋白质、多糖等物质会抑制DNA提取质量；同时还含有盐、糖、油、色素等食品添加剂，此外，加工过程中的煎、炸、煮、烤等工艺也会使原料中的DNA会受到不同程度的损坏。因此，从加工食品中提取DNA比从原材料中提取DNA相对的困难。所以目前国内外对辣椒及制品中转基因成分检测技术研究较少，检测技术无法跟进辣椒转基因技术的发展，既不利于转基因物种监管，也不利于避免国际贸易中设置的技术壁垒。解决上述技术问题的难度和意义：目前针对辣椒的转基因研究，多集中于遗传育种研究机构对其各自研发品种进行的分析，如进行转抗菌肽基因辣椒蛋白质检测，辣椒农杆菌介导转化体系的建立及外源基因的转化、抗CMV和TMV转基因线辣椒等，为辣椒转基因品种的表达分析研究，没有针对市场上常见辣椒转基因品种进行有效的、通用的检测技术研究，检测技术无法跟进辣椒转基因技术的发展，既不利于转基因物种监管，也不利于避免国际贸易中设置的技术壁垒。本专利技术通过对核酸提取技术与实时荧光PCR检测方法的应用，为辣椒及制品转基因风险的分析，提供了技术支撑和保障，保证生物安全，保障人民的消费安全，对促进我国辣椒及制品对外贸易的迅速发展起到积极的作用，这也对促进对外经济发展，增加农民收入将起到很大作用，将发挥显著的经济效益。尤其是目前中国在全球辣椒种植和贸易中占有较大比重，其转基因问题也越来越受到国际社会关注，国际社会常以转基因问题政治化的情况下，本专利技术产生的社会效益显得尤为重要。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种辣椒及制品中转基因成分检测及应用方法。本专利技术针对油辣椒制品的成分特点，目的在于提供一种简单、快速、高效的获取高质量DNA的方法，为辣椒制品转基因检测的科研工作奠定基础。本专利技术是这样实现的，一种辣椒及制品中转基因成分检测方法为：步骤一：样品前处理：采用洗涤方式，去除样品中的其他物质；步骤二：核酸提取：改良CTAB法进行辣椒制品核酸提取步骤三：建立检测方法：针对辣椒转基因基团设计特异性的荧光PCR引物、探针，其序列为：上游引物TMV1序列(CATCCCAATTCGTGTTCTTGTC)，下游引物TMV2序列(CTTGTTGTGTTTGAAACTGATTTCCT)，探针TMVProber序列(FAM-TCAGCGTGGGCCGACCCAAT-TAMRA)建立并优化反应条件(反应体系为：PremixExTaqTM(2×)12.5μL、上游引物TMV1(10μM)1μL、下游引物TMV2(10μM)1μL、探针TMVProbe0.5μL、ROXReferenceDye(50×)0.5μL、DNA模板3μL、灭菌ddH2O6.5μL；反应程序为：95℃预变性3min，{95℃变性10s,60℃退火、延伸40s}×40个循环)，达到最佳反应设置。进一步，步骤一中，其他物质为油、盐、糖、添加剂及其发酵产物一种或两种及以上。进一步，步骤二中，辣椒制品中DNA提取步骤如下：(1)取适量样品与2倍体积的超纯水至50mL离心管中，充分混匀，于离心机离心5min(12000rpm/min)，弃上清，重复洗涤3～5次；液体样品(辣椒酱、油辣椒等)，可使用均质器破坏样品的稳定性并加以分离、浓缩，取适量样品与2倍体积的超纯水至2mL离心管中，充分混匀，于离心机离心5min(12000rpm/min)弃上清，重复洗涤3～5次；(2)取样品约0.3g置于球磨仪(液氮处理)研磨，加入700μL提取液TK(TK提取液组成为：4.00gCTAB、16.38gNaCl、2.42gTris-base和1.50gNa2EDTA，pH＝8.0)，轻轻搅动，将磨碎液倒入1.5ml的灭菌离心管中，于56℃金属浴加热振荡30min，加入5μL5mol/L醋酸钾溶液，混匀，再56℃金属浴20min；(3)取出离心管后放置在冰上，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻来回颠倒，充分混匀；放入4℃高速冷冻离心机中(12000rpm)离心15min；(4)吸取上清液500μL放入另一离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，放入-20℃冰箱中15min；(5)12000rpm离心5min后，弃上清，加入500μL75％乙醇，轻弹离心管，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中，放置10min，使DNA块状物上的不纯物溶解；(6)12000rpm离心5min后弃上清，加入等量75％乙醇再洗10min，12000rpm离心5min后，弃上清液，并将离心管倒立于滤纸之上，自然风干，加入50μLTE溶液，使DNA溶解,置于-20℃冰箱冷冻保存、待用。本专利技术的另一目的在于提供一种辣椒及制品中转基因成分检测方法的应用方法，具体为：步骤一：方法验证：对以上建立的实时荧光PCR检测方法进行方法验证，同时对检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种辣椒及制品中转基因成分检测方法，其特征在于，所述辣椒及制品中转基因成分检测方法为：步骤一：样品前处理：采用洗涤方式，去除样品中的其他物质；步骤二：核酸提取：改良CTAB法进行辣椒制品核酸提取；步骤三：建立检测方法：针对辣椒转基因基团设计特异性的荧光PCR引物、探针，建立并优化反应条件，达到最佳反应设置；探针，其序列为：上游引物TMV1序列CATCCCAATTCGTGTTCTTGTC，下游引物TMV2序列CTTGTTGTGTTTGAAACTGATTTCCT，探针TMV Prober序列FAM‑TCAGCGTGGGCCGACCCAAT‑TAMRA建立并优化反应条件；反应体系为：Premix Ex TaqTM(2×)12.5μL、上游引物TMV1(10μM)1μL、下游引物TMV2(10μM)1μL、探针TMV Probe 0.5μL、ROX Reference Dye(50×)0.5μL、DNA模板3μL、灭菌ddH2O 6.5μL；反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s,60℃退火、延伸40s，40个循环。

【技术特征摘要】
1.一种辣椒及制品中转基因成分检测方法，其特征在于，所述辣椒及制品中转基因成分检测方法为：步骤一：样品前处理：采用洗涤方式，去除样品中的其他物质；步骤二：核酸提取：改良CTAB法进行辣椒制品核酸提取；步骤三：建立检测方法：针对辣椒转基因基团设计特异性的荧光PCR引物、探针，建立并优化反应条件，达到最佳反应设置；探针，其序列为：上游引物TMV1序列CATCCCAATTCGTGTTCTTGTC，下游引物TMV2序列CTTGTTGTGTTTGAAACTGATTTCCT，探针TMVProber序列FAM-TCAGCGTGGGCCGACCCAAT-TAMRA建立并优化反应条件；反应体系为：PremixExTaqTM(2×)12.5μL、上游引物TMV1(10μM)1μL、下游引物TMV2(10μM)1μL、探针TMVProbe0.5μL、ROXReferenceDye(50×)0.5μL、DNA模板3μL、灭菌ddH2O6.5μL；反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s,60℃退火、延伸40s，40个循环。2.如权利要求1所述的辣椒及制品中转基因成分检测方法，其特征在于，所述步骤一中，其他物质为油、盐、糖、添加剂及其发酵产物一种或两种及以上。3.如权利要求1所述的辣椒及制品中转基因成分检测方法，其特征在于，所述步骤一中，辣椒制品中DNA提取步骤如下：(1)取适量样品与2倍体积的超纯水至50mL离心管中，充分混匀，于离心机离心5min，弃上清，重复洗涤3～5次；液体样品，可使用均质器破坏样品的稳定性并加以分离、浓缩，取适量样品与2倍体积的...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗阿东，王艳，吴山楠，蔡秋，
申请(专利权)人：贵州出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心贵州国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：贵州,52