一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-A117C-C4334A及构建方法技术

本发明专利技术公开了一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA‑A117C‑C4334A及构建方法，所述的突变基因ISA‑A117C‑C4334A以3型鸭甲肝病毒强毒株基因组5'UTR的第117位核苷酸由A突变为C；第4334位核苷酸由C突变为A，从而使病毒2C蛋白的第71位氨基酸由亲本株的亮氨酸突变为异亮氨酸。突变基因病毒株对雏鸭致病力已明显下降，突变基因病毒株能够在雏鸭体内复制但对雏鸭不致病，具有良好的安全性，这为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础。3型鸭甲肝病毒突变基因ISA‑A117C‑C4334A病毒株是一株理想的疫苗候选株；同时，也为鸭肝炎病毒宿主嗜性和毒力变化的病毒基因及其关键位点研究提供了基础材料，应用前景广阔。

A Mutant Gene ISA-A117C-C4334A of Duck Hepatitis A Virus Type 3 and Its Construction Method

【技术实现步骤摘要】
一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-A117C-C4334A及构建方法
本专利技术属于基因工程
，具株涉及一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-A117C-C4334A及构建方法。
技术介绍
鸭病毒性肝炎(Duckviralhepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(Duckhepatitisvirus，DHV)感染雏鸭引起的一种急性、高度接触性传染病。目前世界上主要养鸭地区均有本病的存在，具有间歇爆发、地方流行性等特点，是危害养鸭业的主要疾病之一。该病主要侵害四周龄以内的雏鸭，具有发病急，传播迅速，病程短和死亡率高等特点；临床主要表现为雏鸭死前发生痉挛，头向背部后仰，呈“角弓反张”，病理变化主要为剖检可见肝脏肿大发炎和大量的出血性斑点。该病主要由属于小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲肝病毒(DuckhepatitisAvirus，DHAV)引起。DHAV具有三种血清型，即1型、2型和3型。近年来，我国流行的DHAV主要是1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)和3型鸭甲肝病毒(DHAV-3)。反向遗传操作技术是开展病毒分子生物学研究的一种重要平台，可以在体外对RNA病毒基因组进行基因敲除、定点诱变等人工操作，在阐明病毒致病机制和疫苗研制中能够发挥重要作用并具比自然诱变周期短的优点。传统RNA病毒感染性克隆方法的关键是获得病毒基因组cDNA全长片段克隆，并且病毒基因组转换为cDNA后需要克隆到合适的载体中，为了避免病毒序列在细菌中的不稳定问题，研究者通常采取分段克隆方法，通过小片段连接成大片段，最后将大片段通过酶切连接的方法得到全长cDNA克隆。但是该方法酶切位点选取限制较多，体外将多个大片段进行连接效率较低，另外一些复制酶基因cDNA克隆在细菌中具有不稳定性，因此获得病毒基因组全长cDNA的整个过程不仅操作步骤麻烦，而且耗时较长，成功率不高，同时，有些病毒的全长cDNA无法克隆或是虽然能克隆进载体但在宿主菌中易发生变异而导致不能成功拯救病毒。目前，一种被称为“感染性亚基因组复制子(InfectiousSubgenomicAmplicons)”的技术已被证实能够在哺乳动物或蚊子细胞中实现对单股正链RNA病毒的人工拯救，并被应用于日本脑炎病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒、黄热病病毒、登革病毒和人科萨奇病毒等病毒的反向遗传学研究中。该技术是一种新型的“无细菌”反向遗传学方法，不需要获得病毒全长cDNA质粒以及在体外获得病毒RNA转录本，可以直接通过转染具有同源区域的DNA片段拯救病毒。具体的的来说，“感染性亚基因组复制子”采用的技术路线是：首先通过PCR方法产生包含整个病毒基因组的重叠的非感染性亚基因组DNA片段，这些重叠的亚基因组复制子数量可以为3至10个，相邻的复制子之间具有100bp左右的重叠区域，同时，第一个片段的5'和最后一个片段的3'末端分别侧接巨细胞病毒早期启动子(Cytomegalovirusimmediateearlypromoter，pCMV)序列、丁型肝炎病毒核酶(Hepatitisdeltavirusribozyme，HDVR)序列和猴空泡病毒早期mRNA多腺苷酸化信号(SV40earlymRNApolyadenylationsignal，SV40pA)序列，这些元件能够帮助亚基因组复制子在被混合转染到易感细胞后开始转录，并利用宿主细胞的同源重组机制自发重组，形成具有感染性的完整病毒转录本，继而导致病毒的复制与增殖，最终获得具有感染性的拯救病毒。当前市场上对DHAV的防控主要是使用DHAV-1弱毒疫苗，尚缺乏高效的DHAV-3活疫苗，研发适合我国DHAV-3流行情况的新型分子标记疫苗迫在眉睫；同时，DHAV宿主嗜性及毒力变化的病毒基因及关键位点等基础研究可为鸭肝炎的防治提供理论依据，这也迫切需要获得宿主嗜性及毒力变化的病毒株。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，利用基因改造平台获得分子标记3型鸭甲肝病毒疫苗候选毒株；同时，获得毒力变化的病毒株可为研究DHAV毒力变化的病毒基因及关键位点等提供基础材料。为了实现上述技术目的，本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-A117C-C4334A，所述的突变基因ISA-A117C-C4334A以3型鸭甲肝病毒强毒株基因组5'UTR的第117位核苷酸由A突变为C；第4334位核苷酸由C突变为A，从而使病毒2C蛋白的第71位氨基酸由亲本株的亮氨酸突变为异亮氨酸。所述的3型鸭甲肝病毒(DuckHepatitisAVirustype3，DHAV-3)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V201305，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2013年3月25日。所述的突变基因基因组第3403位核苷酸的G突变为T，作为感染性克隆的遗传标记，可通过PCR方法结合DNA测序来区分突变基因与亲本株以及野毒株。本专利技术含有遗传标记的突变基因病毒株与亲本病毒一样能够在9日龄鸭胚上稳定增殖传代且病毒滴度更高，还能在鸡胚9日龄鸡胚上稳定增殖传代，遗传稳定性良好，连续传代10次未出现突变。本专利技术含有遗传标记的突变基因病毒株相对于亲本病毒，突变基因对雏鸭致病力已明显下降，突变基因成功在雏鸭株内复制但对雏鸭不致病。在本专利技术的另一方面，提供了上述突变基因在制备3型鸭肝炎病毒疫苗中的应用。同时该突变基因也可用在鸭肝炎病毒宿主嗜性和毒力变化的病毒基因及关键位点基础研究中。在本专利技术的另一方面，提供了上述突变基因病毒株的构建方法，包括以下步骤：(1)将亲本病毒全基因组分为大小相近的三个片段进行PCR扩增，第一个片段和第三个片段分别与第二个片段含有74个和83个碱基对的重叠区域；在病毒基因组第一个片段的5'端添加巨细胞病毒早期启动子(Cytomegalovirusimmediateearlypromoter，pCMV)且在5'UTR中引入突变位点，第二个片段的2C基因中引入突变位点且2A基因无义突变作为遗传标记位点，在病毒基因组第三个片段的3'端添加丁型肝炎病毒核酶(Hepatitisdeltavirusribozyme，HDVR)序列和猴空泡病毒早期mRNA多腺苷酸化信号(SV40earlymRNApolyadenylationsignal，SV40pA)序列，获得三个DNA片段构成3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-A117C-C4334A“感染性亚基因组复制子”；(2)将构建的3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-A117C-C4334A“感染性亚基因组复制子”与转染试剂混合后转染鸭胚成纤维细胞，复制子在宿主细胞内转录并利用细胞的同源重组机制自发重组，形成具有感染性的完整病毒转录本，继而导致病毒的复制与增殖，最终获得含有遗传标记的3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-A117C-C4334A病毒株。进一步的，第一个片段和第三个片段分别与第二个片段含有74个和83个碱基对的重叠区域。本专利技术的有益效果为：1、利用本专利技术方法获得3型鸭甲肝病毒突变基因比自然方法诱变和传统反向遗传操作技术的时间周期短，可加快3型鸭甲肝病毒弱毒疫苗毒株的培育和病毒致病机制研究的进程。2、本专利技术中获得的突变基因ISA-A117C-C4334A具有与其亲本毒株相似的抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA‑A117C‑C4334A，其特征在于，所述的突变基因ISA‑A117C‑C4334A以3型鸭甲肝病毒强毒株基因组5’UTR的第117位核苷酸由A突变为C；第4334位核苷酸由C突变为A，从而使其2C蛋白的第71位氨基酸由亮氨酸突变为异亮氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-A117C-C4334A，其特征在于，所述的突变基因ISA-A117C-C4334A以3型鸭甲肝病毒强毒株基因组5’UTR的第117位核苷酸由A突变为C；第4334位核苷酸由C突变为A，从而使其2C蛋白的第71位氨基酸由亮氨酸突变为异亮氨酸。2.根据权利要求1所述的一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-A117C-C4334A，其特征在于，所述的3型鸭甲肝病毒强毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V201305。3.根据权利要求1所述的一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-A117C-C4334A，其特征在于，所述的突变基因基因组第3403位核苷酸的G突变为T，作为感染性克隆的遗传标记。4.权利要求1所述的3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-A117C-C4334A病毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将亲本病毒全基因组分为大小相近的三个片段进行扩增，在病毒基因组第一个片段的5'端添加巨细胞病毒早期启动子且5'UTR的第117位核...

【专利技术属性】
技术研发人员：文兴建，程安春，汪铭书，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51