本发明专利技术涉及食品检测技术领域，具体涉及一种基于LC‑MS/MS测定猪肉丸中猪肉含量的方法；本发明专利技术选择筛选出来定量较好的猪肉多肽作为分析对象，通过前处理方法提取待测猪肉丸中猪肉特异性多肽，然后进行LC‑MS/MS分析，同时建立普通猪肉对应多肽的标准曲线，以已知猪肉的含量作为横坐标，猪肉定量多肽的峰面积作为纵坐标，从而得到待测猪肉丸中猪肉含量。本发明专利技术基于高效液相色谱‑质谱联用技术建立了一种测定猪肉丸中猪肉含量的方法，从而实现对猪肉丸中猪肉含量的检测，该技术体系的建立也将为规范行业标识、维护市场公平提供强有力的技术支持。
A method for determination of pork content in pork balls based on LC-MS/MS
【技术实现步骤摘要】
一种基于LC-MS/MS测定猪肉丸中猪肉含量的方法
本专利技术涉及食品检测
，具体涉及一种基于LC-MS/MS测定猪肉丸中猪肉含量的方法。
技术介绍
速冻猪肉丸一直很受消费者追捧，尤其是冬季，销量更大。目前市面上猪肉丸质量参差不齐，价格差异显著。速冻肉丸的价格与所含纯肉的含量密切相关，高的一般维持在30％-40％，低的不足10％，只有少数厂家的肉馅含量占到产品净质量的80％，可谓参差不齐。不仅如此，少数生产商的肉丸名称与主料完全不相符，部分厂商则并不提及主料含量。速冻肉丸在生产制作过程中还会加入添加剂，如添加焦磷酸钠、三聚磷酸钠等以增加肉制品的弹性和口感。但消费者从外观很难辨识出来，只觉得吃起来香、有筋道。目前速冻肉丸的执行标准主要包括SB/T10379-2012《速冻调制食品》和SB/T10610-2011《肉丸》。SB/T10610-2011规定了肉丸按照含肉量分为三个等级，即特级、优级和普通级，含肉量分别大于65％、55％和45％。SB/T10379-2012仅规定主料占产品净质量比例。但这两个标准都没有对应含肉量的测定方法。目前市售的肉丸部分企业标注了含肉量，但也是企业自行标定的，最重要的是缺乏相应的技术手段判断其是否真实、准确。因此建立测定丸子中物种的定性及定量方法顺应市场需求，该技术体系的建立也将为规范行业标识、维护市场公平提供强有力的技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于LC-MS/MS测定猪肉丸中猪肉含量的方法；本专利技术选择筛选出来定量较好的猪肉多肽作为分析对象，通过前处理方法提取待测猪肉丸中猪肉特异性多肽，然后进行LC-MS/MS分析，同时建立普通猪肉对应多肽的标准曲线，以已知猪肉的含量作为横坐标，猪肉定量多肽的峰面积作为纵坐标，从而得到待测猪肉丸中猪肉含量。具体而言，本专利技术提供的基于LC-MS/MS测定猪肉丸中猪肉含量的方法，以多肽作为检测的分析对象；所述多肽信息如下：进一步的，本专利技术所述的方法还包括对待测猪肉丸进行预处理的步骤：(1)将所述待测猪肉丸研磨均匀，向0.1～0.5g猪肉丸中加入1～5ml缓冲盐提取液，冷冻研磨后离心，取上清液；(2)取20～300μL上清液，加入50mmoL/L二硫苏糖醇溶液10～50μL，56℃振荡反应1h，降温后加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20～100μL，暗处反应30min；(3)向上述反应体系中加入50mmol/LNH4HCO3100μL，然后加入20μg胰蛋白酶，37℃反应过夜；向上述酶解液中加入10％醋酸调pH<2终止反应，并加入1mL0.1％乙酸水，所得溶液用于过柱除盐；(4)将步骤(3)所得溶液用HLB固相萃取柱除盐，收集洗脱液过滤后，准备上机；其中，步骤(1)中所述缓冲盐提取液为0.05mol/LTris-HCl、6mol/L尿素、2mol/L硫脲，pH8.0。进一步的，步骤(1)中，所述冷冻研磨的条件为：在60Hz下研磨45s；所述离心的条件为：15000r/min离心10min。进一步的，步骤(4)中依次用乙腈、0.1％乙酸水活化HLB固相萃取柱，将步骤(3)所得溶液上样，再依次用水、0.5％乙酸淋洗，最后用1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脱，收集的洗脱液经0.22μm滤膜过滤。进一步的，本专利技术所述的方法还包括建立猪肉标准曲线的步骤：(1)称取0.1～0.5g猪肉，加入1～5mL缓冲盐提取液，冷冻研磨后离心，取上清液；(2)取20～300μL上清液，加入50mmoL/L二硫苏糖醇溶液10～50μL，56℃振荡反应1h，降温后加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20～100μL，暗处反应30min；(3)向上述反应体系中加入50mmol/LNH4HCO3100μL，然后加入20μg胰蛋白酶，37℃反应过夜；向上述酶解液中加入10％醋酸调pH<2终止反应，并加入1mL0.1％乙酸水，所得溶液用于过柱除盐；(4)将步骤(3)所得溶液用HLB固相萃取柱除盐，收集洗脱液过滤后，准备上机；其中，步骤(1)中所述缓冲盐提取液为0.05mol/LTris-HCl、6mol/L尿素、2mol/L硫脲，pH8.0。进一步的，步骤(1)中，所述冷冻研磨的条件为：在60Hz下研磨45s；所述离心的条件为：15000r/min离心10min。进一步的，步骤(4)中依次用乙腈、0.1％乙酸水活化HLB固相萃取柱，将步骤(3)所得溶液上样，再依次用水、0.5％乙酸淋洗，最后用1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脱，收集的洗脱液经0.22μm滤膜过滤。进一步的，LC-MS/MS的条件如下：色谱条件：色谱柱HypersilGOLDC18；流动相：A相0.1％FA/H2O，B相0.1％FA/ACN，色谱梯度为：0～2min，5％B；2～10min,5％～40％B；10～16min，40％～80％B；16～18min，80％～5％B；质谱条件：喷雾电压3000V；离子源雾化温度350℃；离子传输管温度300℃；鞘气45Arb；辅气15Arb；碰撞气为1.5mTorr；正模式。进一步的，本专利技术所述的方法还包括判定待测猪肉丸中猪肉含量的步骤：以猪肉的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线；用所述标准工作曲线得到待测猪肉丸中猪肉的含量。本专利技术的有益效果：本专利技术基于高效液相色谱-质谱联用技术建立了一种测定猪肉丸中猪肉含量的方法，从而实现对猪肉丸中猪肉含量的检测，该技术填补了国内空白，打破速冻肉丸肉含量标示仅有企业标识依据为主导，为监管部门执法提供了技术支撑，为规范速冻肉丸市场行为提供了技术保障。附图说明图1Pig_1的多反应检测谱图。图2Pig_2的多反应检测谱图。图3Pig_3的多反应检测谱图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1本实施例提供一种基于LC-MS/MS测定猪肉丸中猪肉含量的方法，具体包括如下步骤：1、待测猪肉丸的预处理(1)将待测猪肉丸用制样机研磨均匀，称取0.5g，加入5ml缓冲盐提取液，液氮冷冻研磨45s，15000r/min离心10min，取上清液300μL至管中；(2)向管中加入50mmoL/L二硫苏糖醇溶液10μL，56℃振荡反应1h，降温后加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20μL，暗处反应30min；(3)向上述反应体系中加入50mmol/LNH4HCO3100μL，然后加入20μg胰蛋白酶(万分之一醋酸溶解)，37℃反应过夜；向上述酶解液中加入10％醋酸调pH<2终止反应，并加入1mL0.1％乙酸水，所得溶液用于过柱除盐；(4)将步骤(3)所得溶液用HLB固相萃取柱(依次用乙腈、0.1％乙酸水活化)除盐，再依次用水、0.5％乙酸淋洗，最后用1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脱，收集的洗脱液经0.22μm滤膜过滤，准备上机。2、猪肉标准曲线的建立(1)称取0.5g猪肉(若为冷冻猪肉，需化冻)，加入5ml缓冲盐提取液，液氮冷冻研磨45s，15000r/min离心10min，分别取上清液20μL、50μL、100μL、200μL、300μL至5个管；(2)向5个管中分别加入50mmoL/L二硫苏糖醇溶液10μL，56℃振荡反应1h，降温后加入1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于LC‑MS/MS测定猪肉丸中猪肉含量的方法，其特征在于，以多肽作为检测的分析对象；所述多肽信息如下：
【技术特征摘要】
1.一种基于LC-MS/MS测定猪肉丸中猪肉含量的方法，其特征在于，以多肽作为检测的分析对象；所述多肽信息如下：。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对待测猪肉丸进行预处理的步骤：(1)将所述待测猪肉丸研磨均匀，向0.1～0.5g猪肉丸中加入1～5ml缓冲盐提取液，冷冻研磨后离心，取上清液；(2)取20～300μL上清液，加入50mmoL/L二硫苏糖醇溶液10～50μL，56℃振荡反应1h，降温后加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20～100μL，暗处反应30min；(3)向上述反应体系中加入50mmol/LNH4HCO3100μL，然后加入20μg胰蛋白酶，37℃反应过夜；向上述酶解液中加入10％醋酸调pH<2终止反应，并加入1mL0.1％乙酸水，所得溶液用于过柱除盐；(4)将步骤(3)所得溶液用HLB固相萃取柱除盐，收集洗脱液过滤后，准备上机；其中，步骤(1)中所述缓冲盐提取液为0.05mol/LTris-HCl、6mol/L尿素、2mol/L硫脲，pH8.0。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述冷冻研磨的条件为：在60Hz下研磨45s；所述离心的条件为：15000r/min离心10min。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中依次用乙腈、0.1％乙酸水活化HLB固相萃取柱，将步骤(3)所得溶液上样，再依次用水、0.5％乙酸淋洗，最后用1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脱，收集的洗脱液经0.22μm滤膜过滤。5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，还包括建立猪肉标准曲线的步骤：(1)称取0.1～0.5g猪肉，加入1～5mL缓冲盐提取液，冷冻研磨后离心，取上清液...
【专利技术属性】
技术研发人员：王守伟，李莹莹，张颖颖，李家鹏，李石磊，马燕红，李慧晨，陈超，赵奕昕，
申请(专利权)人：中国肉类食品综合研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11
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