【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法
本专利技术涉及一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，一种凝血酶含量的检测方法，具体涉及一种核酸适体捕获凝血酶，暴露末端端粒酶识别引物。利用端粒酶识别引物并进行核酸扩增，得到富含鸟嘌呤（G）的重复产物，与血晶素结合后进行可视化检的方法。本专利技术属于纳米生物检测领域。
技术介绍
正常人体内凝血和抗凝血机制维持着动态的平衡，然而肿瘤组织的产生、向周围组织的浸润和转移，以及肿瘤患者血液成分的变化会影响这种平衡状态，导致患者的凝血机制发生改变，产生不同程度的出血倾向。研究表明，肿瘤与血栓发生存在相关性，特别恶性肿瘤细胞在治疗过程中本身可以释放促凝因子和癌促凝物，并且其受多种血细胞作用影响，可以逐步破坏人体正常的凝血、溶血和纤溶系统，促使恶性肿瘤患者血液产生高凝状态。而这种高凝状态在一定程度上又有助于肿瘤细胞的生长，并导致进一步的浸润和转移。凝血酶（Thrombin,Tb）是一种重要的多功能丝氨酸蛋白酶，由Tb前体形成，位于外源性和内源性凝血途径的共同通路中，具有催化纤维蛋白元变成纤维蛋白、促进血液凝血和调控凝血的功能，...
【技术保护点】
1.一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，其特征在于，以凝血酶为靶标，采用核酸适体识别靶标，并利用端粒酶扩增的方式进一步放大信号，同时结合磁分离的手段，实现凝血酶的可视化检测，包括如下步骤：采用生物素修饰的探针与链霉亲和素修饰的磁珠连接，在磁珠表面修饰识别凝血酶的探针，探针包括凝血酶核酸适体序列及端粒酶识别序列，探针与靶标结合后，暴露探针末端端粒酶识别序列；所述的端粒酶（telomerase）是一种由RNA和蛋白质构成的一种核糖核蛋白，与相应的识别引物结合后，以自身RNA的模板区为模板，在dNTP存在的条件下，在引物末端添加6个碱基的重复序列（AGGGTT），该序列...
【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，其特征在于，以凝血酶为靶标，采用核酸适体识别靶标，并利用端粒酶扩增的方式进一步放大信号，同时结合磁分离的手段，实现凝血酶的可视化检测，包括如下步骤：采用生物素修饰的探针与链霉亲和素修饰的磁珠连接，在磁珠表面修饰识别凝血酶的探针，探针包括凝血酶核酸适体序列及端粒酶识别序列，探针与靶标结合后，暴露探针末端端粒酶识别序列；所述的端粒酶（telomerase）是一种由RNA和蛋白质构成的一种核糖核蛋白，与相应的识别引物结合后，以自身RNA的模板区为模板，在dNTP存在的条件下，在引物末端添加6个碱基的重复序列（AGGGTT），该序列可以与氯化血红素（hemin或称血晶素）结合，形成具有类过氧化物酶活性的复合物，采用化学发光的方式对凝血酶含量进行定量分析。2.根据权利要求1所述基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，其特征在于：所述的探针由一个发夹结构DNA构成，包含识别凝血酶的核酸适体序列与端粒酶识别引物序列，探针在与凝血酶充分结合后，打开茎环结构，采用磁性分离的方法对凝血酶进行富集与纯化，去除未结合物质，纯化后的磁珠重新分散，加入端粒酶，端粒酶识别暴露的引物序列，在探针末端形成重复的富含鸟嘌呤的序列，磁分离去除多余的酶与dNTP，进一步地，加入血晶素（hemin），形成具有过氧化物酶活性的复合物，催化2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）显色，对凝血酶的含量进行可视化测定。3.根据权利要求1或2所述基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）链霉亲和素修饰磁珠连接生物素修饰的探针：取10μL100μM生物素修饰的探针序列，包括核酸序列表中Seq.No.1DNA1或Seq.No.2DNA2，于90℃孵育5min，缓慢降至室温，使探针序列形成发夹结构，记为hairpin-DNA；取100μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-beads）置于磁力架上，1min后移除上清液，沉淀采用500μL缓冲液I重悬，所述的缓冲液I为10mMTris-HCl、1mMEDTA、1MNaCl，pH=7.5；10μL100μM的hairpin-DNA与5~10μL100μM的Seq.No.3DNA3以摩尔比1...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐艳，张兆坤，陈玮嘉，朱君，王萍，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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