利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆制造技术

利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆，属于基因工程技术领域，其特征在于：细胞克隆被分离纯化且经过2％马血清诱导分化后可以形成肌纤维；该骨骼肌卫星细胞具有融合为肌管的能力；MSTN基因敲除载体靶位点已成功连接，未发生碱基突变；实验组细胞经分化能够形成一定数目的肌管，表明干扰MyoG基因后，细胞依然能够分化成为肌管，但总体肌管融合率降低，形态和数目较对照组有极显著差异。

Preparation of MyoG gene knockout and MSTN gene knockout cell clones by Crispr/Cas9 Technology

【技术实现步骤摘要】
利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆
本专利技术涉及利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆，属于基因工程

技术介绍
转基因技术已成为现代动物育种技术的重要手段，被公认是遗传学研究中继20世纪初的连锁分析、60年代的体细胞遗传和70年代基因克隆技术之后的第四代技术，被列为生物学发展史上的转折点。传统的动物品种改良只能在同种或亲缘关系很近的物种之间进行，且以自然突变作为选种的前提，这种自然突变的发生几率相当低。转基因技术则可以克服上述问题，创造新突变或打破物种间基因交流限制，加快动物改良进程。目前转基因技术已经成功地应用在提高动物个体的生长速度、改良家畜的生产品质和增强抗逆、抵御疾病的能力等方面。例如，1998年美国农业部研究人员成功获得了促生长转基因猪(胰岛素样生长因子)。显著改变了猪的产肉性能，猪肉脂肪含量减少10％，瘦肉含量增加6％～8％，显著提高了猪的经济性能。Wall等利用转基因的方法得到了牛乳腺特异表达溶葡球菌酶(Lysostaphin)的转基因牛，转基因牛乳房进行金黄色葡萄球菌培养物注射实验发现，与非转基因牛相比较，转基因牛乳房抗菌能力提高5倍，为畜牧业中疾病的防治提供一个新的可行的路线。2003年，Brophy等培育的转基因牛牛奶中β-酪蛋白的含量提高了20％，κ-酪蛋白的含量也增加了2倍，很大程度上提高了牛乳乳蛋白含量，增加了牛乳的营养价值。目前，我国科学家已经利用转基因技术在动物育种中获得了一些成就，如2010年，内蒙古大学李光鹏教授课题组获得了转线虫Fat-1转基因牛，多不饱和脂肪酸比值得到明显提高。食用这种牛肉对于改善人体不饱和脂肪酸组成，预防心脑血管疾病等具有重要作用。2011年，中国农业大学李宁课题组利用锌指酶技术首次获得了MSTN双等位基因敲除牛，该牛臀部肌肉明显比对照普通牛增加。但是在目前的转基因动物育种的研究中通常都是针对单一的基因进行操作，效果有限，且常用的转基因方法操作繁琐，难度大，成功率低，研究成本高。2013年，CRISPR/Cas9技术被应用于转基因操作(CongL，2013；Mali，2013；Hwang，2013；ChangN，2013；ShenB，2013)，它基于细菌的获得性免疫系统改造而成(Westra，2010；Garneau，2010)，其操作简单、成本低、作用高效，适用于大多分子生物学实验室，尤其是不需要抗性基因作为筛选标记，这对动物育种具有重要的意义。它作为新兴的基因组定点编辑技术逐渐成熟并已在多个物种中得到应用，其中包括：大肠杆菌、肺炎双球菌、酿酒酵母、小鼠、果蝇、线虫、大鼠、小麦、水稻、拟南芥中，这为基因功能领域的研究提供广阔前景(Hwang，2013；Gilbert，2013)。肌细胞生成素(Myogenin，MyoG)是生肌调节因子家族成员之一，是肌细胞终末端分化的关键因子，其可以促进成肌细胞的增殖，使单核成肌细胞转变成为多核的肌纤维，在肌细胞的生成过程中起着中心调控作用，这一功能其它生肌调节因子无法代替(胡迎春等，2004；ChargeSB等，2004；Schuster-GosslerK等，2007；VasyutinaE等，2007)。Nabeshima等(1993)通过胚胎干细胞基因打靶使小鼠MyoG基因失活，产生突变纯合小鼠，MyoG基因缺失的小鼠虽有成肌细胞正常存在，但绝大部分细胞不分化形成肌纤维，由于骨骼肌的缺损，这些纯合突变小鼠在出生前后致死。MyoG基因在肌肉形成后也可以发挥着重要作用，Jennifer等(2005)通过Cre-loxP技术在小鼠胚胎肌肉形成之后敲除MyoG发现，MRFs家族其他成员如MyoD和Myf5都有不同程度的下降，小鼠骨骼肌能够正常形成也能够出生并存活，但是出生后的体重比野生型小30％，相同位置的骨骼肌的尺寸与重量均小于野生型。这说明MyoG不仅控制胚胎期的肌肉形成，而且对于出生后的肌肉生长也是极为重要的。在牛和猪中，科学家进行了大量的MyoG基因多态性分析。研究表明MyoG基因的突变位点与猪、牛的初生重有关，MyoG不同的基因型可影响肌纤维的数目，同时影响肉的质量。王珊等(2006)克隆了牛MyoG基因的启动子序列后，采用PCR-RFLP技术研究了该基因启动子序列多态性与牛生长发育性状之间的相关性。结果表明：牛MyoG基因启动子表现出多态性，含有AA、AB基因型。其中AA基因型个体在体高、体重等生长性状指标上显著高于AB型个体，AA基因型为优势基因型。林万华等(2000)也利用PCR-RFLP的方法证实了MyoG基因对猪的胴体性状有显著影响。MyoG由于其基因的多态性能够影响产肉动物的肉质，也使其成为产肉动物生产育种的候选基因。以上这些研究都表明MyoG基因是与肌纤维数目有关的基因，其不同的基因型可影响肌纤维的数目，同时影响了肉的质量。大量的研究表明，脊椎动物的肌肉组织在出生以后肌纤维的数目是不再改变，肌肉的生长主要依赖于肌纤维纤维长度增加和周径增大(BuonannoA等，1996；张海平等，2008；孙文杰等2009)。因此，通过对MyoG基因人为的修饰或改造，增加其表达时间和表达量可能有助于增加肌纤维的数量，从而提高产肉量。肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)是抑制肌肉分化和生长的基因，MSTN通过阻止细胞周期进程实现抑制成肌细胞增殖的功能。大量研究表明，在体外培养的成肌细胞中，MSTN具有阻止细胞周期由G1期向S期的转变的功能，进而抑制成肌细胞的增殖(Thomas，2000；Taylor，2001；Joulia，2003)。McPherron等人通过基因敲除技术使小鼠体内MSTN基因不能发挥作用，结果发现突变小鼠的体型明显大于野生型老鼠，每块骨骼肌质量都是野生型3到4倍，而且MSTN基因失活小鼠骨骼肌纤维的数量比正常野生小鼠高出86％，由这些现象可以推测这些肌肉质量的增加可能是由于MSTN基因失活导致肌细胞增生和肥大造成的。Lin等(2002)成功研制转基因的小鼠，这些小鼠所表达的MSTN发生突变，肌肉重量增加20-35％，研究中还发现肌肉的增加不是由于肌纤维增生而引起的，而是由肌纤维肥大导致的。因此如何根据MyoG基因和MSTN基因在肌肉分化和发育中的重要作用，将目前最先进的基因打靶技术CRISPR/Cas9技术应用于转基因牛的研究中，对MyoG和MSTN两个基因进行操作，同时实现促肌肉分化的MyoG基因的高表达并敲除抑制肌纤维增殖的MSTN基因，研究其对牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖及下游基因表达的影响成为目前养牛生产过程中急需解决的一大难题，所以利用CRISPR/Cas9技术同时对MSTN和MyoG两个基因进行修饰改造，并对改造的牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖情况进行检测，并研究其作用的分子机制。肌纤维的数量将得到增加，肌纤维将发育得更为粗大，从而提高产肉率，进一步通过体细胞核移植技术就可能获得适合本地环境的高产肉牛，研究其对牛骨骼肌卫星细胞分化和增殖及下游基因表达的影响，专利技术利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆是必要的。
技术实现思路
为了克服本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆，其特征在于：所述的细胞克隆被分离纯化且经过2％马血清诱导分化后可以形成肌纤维；利用免疫荧光技术对牛骨骼肌卫星细胞进行鉴定，结果显示，CD34、Sca‑1、Desmin在牛骨胳肌卫星细胞中均呈阳性，随机计数100个细胞，3种抗体的阳性细胞高达98％以上；α‑actin、MHC及MyoG在诱导分化后的肌管中呈阳性表达，表明该骨骼肌卫星细胞具有融合为肌管的能力；MSTN基因敲除载体：BbsI单酶切psPgRNA、pX330，酶切电泳的鉴定结果均与预期大小相符；分别按照预定的设计，合成针对第二外显子和第三外显子的两个靶点的sgRNA的引物，退火后与单酶切的psPgRNA、pX330质粒连接，共获得4个MSTN的敲除载体psPgRNA‑M‑A、pX330‑M‑A、psPgRNA‑M‑B和pX330‑M‑B，可确认靶位点已成功连接，未发生碱基突变；利用RNA干扰技术研究MyoG基因对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：在相差显微镜下观察细胞分化72h后所形成的肌管形态，实验对细胞分化72h后所形成的肌管数目及肌管融合率进行了统计分析，结果表明，实验组细胞经分化能够形成一定数目的肌管，与阴性对照组细胞相比，长肌管所占的比例及短小的肌管所占的比例均有显著差异，表明干扰MyoG基因后，细胞依然能够分化成为肌管，但总体肌管融合率降低，形态和数目较对照组有极显著差异；利用实时荧光定量PCR检测肌肉分化标志性基因MCK的表达变化：结果显示，无论是MyoG基因干扰组还是对照组，进入分化期间的细胞，MCK基因mRNA的表达量显著增加，且随着分化时间的增长，基因表达量呈极显著的上升趋势；但MyoG基因干扰组与对照组相比，MCK基因的表达显著降低。...

【技术特征摘要】
1.利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆，其特征在于：所述的细胞克隆被分离纯化且经过2％马血清诱导分化后可以形成肌纤维；利用免疫荧光技术对牛骨骼肌卫星细胞进行鉴定，结果显示，CD34、Sca-1、Desmin在牛骨胳肌卫星细胞中均呈阳性，随机计数100个细胞，3种抗体的阳性细胞高达98％以上；α-actin、MHC及MyoG在诱导分化后的肌管中呈阳性表达，表明该骨骼肌卫星细胞具有融合为肌管的能力；MSTN基因敲除载体：BbsI单酶切psPgRNA、pX330，酶切电泳的鉴定结果均与预期大小相符；分别按照预定的设计，合成针对第二外显子和第三外显子的两个靶点的sgRNA的引物，退火后与单酶切的psPgRNA、pX330质粒连接，共获得4个MSTN的敲除载体psPgRNA-M-A、pX330-M-A、psPgRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：李树峰，佟慧丽，严云勤，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23