【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas9技术的牛磺酸转运体基因敲除大鼠模型的构建方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种基于CRISPR/Cas9技术的牛磺酸转运体基因敲除大鼠模型的构建方法。
技术介绍
牛磺酸(Taurine，Tau)是一种含硫氨基酸，能调节细胞渗透压，防止细胞内钙超载，减少自由基产生，改善细胞膜的通透性，防止细胞肿胀变形，是婴儿中枢神经系统发育期间的重要营养因子，有增强突触传递，缓解中风、癫痫、神经退行性疾病症状等神经保护作用。Tau主要是由细胞膜上的牛磺酸转运体(taurinetransporter，TauT；基因序列Slc6a6，NC_005103.4)转运至细胞内，以维持细胞内Tau的高浓度，TauT是由621个氨基酸残基组成的约74kDa的蛋白质，包含12个跨膜螺旋区。在急性损伤发生后，细胞内的Tau可调节脑细胞渗透压，改善神经元肿胀。本课题组前期实验证实颅脑创伤后细胞膜上TauT的活性失调，脑水含量和水通道蛋白4的表达升高，损伤神经元等。为研究Tau缺乏对机体的影响，研究人员通常是用补充TauT抑制剂如β-丙氨酸等干扰Tau吸收的方法制作...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas9技术的牛磺酸转运体基因敲除大鼠模型的构建方法，其特征在于：包含以下步骤：步骤1：针对TauT基因第5外显子，选择2个sgRNA的作用靶点，合成两对寡聚核苷酸链，退火后，连入经BsaI酶切回收的pUC57‑sgRNA表达载体，构建得到sgRNA表达载体；步骤2：将Cas9表达质粒经AgeⅠ酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板，经体外转录获得Cas9 mRNA；将步骤1中构建得到的sgRNA表达载体经DraⅠ酶切线性化后，经酚氯仿抽提纯化，溶于无核酸酶的水中作为模板，经体外转录获得sgRNA；步骤3：将所述Cas9 mRN...
【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9技术的牛磺酸转运体基因敲除大鼠模型的构建方法，其特征在于：包含以下步骤：步骤1：针对TauT基因第5外显子，选择2个sgRNA的作用靶点，合成两对寡聚核苷酸链，退火后，连入经BsaI酶切回收的pUC57-sgRNA表达载体，构建得到sgRNA表达载体；步骤2：将Cas9表达质粒经AgeⅠ酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板，经体外转录获得Cas9mRNA；将步骤1中构建得到的sgRNA表达载体经DraⅠ酶切线性化后，经酚氯仿抽提纯化，溶于无核酸酶的水中作为模板，经体外转录获得sgRNA；步骤3：将所述Cas9mRNA、sgRNA混合，并添加同源重组donor，通过显微注射法注射到SD大鼠受精卵的雄性胞核和细胞质中，再植入假孕大鼠体内，繁殖得到F0代大鼠；步骤4：将步骤3获得的F0代大鼠进行基因型鉴定，筛选获得F0代杂合子大鼠，将F0代杂合子大鼠与野生型SD大鼠合笼，得到F1代杂合子大鼠；步骤5：将F1代杂合子大鼠与野生型SD大鼠合笼，得到F2代杂合子大鼠；步骤6：将F2代杂合子大鼠自交后，得到F3代纯合子大鼠，即得到牛磺酸转运体基因敲除大鼠模型。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9技术的牛磺酸转运体基因敲除大鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤1中的两对寡聚核苷酸链分别为Rat-Slc6a6-gRNA1、Rat-Slc6a6-gRNA2；所述Rat-Slc6a6-gRNA1包括：Rat-Slc6a6-gRNA1-up:TAGGCCCCTTTGTCCCACAGAC，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；和Rat-Slc6a6-gRNA1-down:AAACGTCTGTGGGACAAAGGGG，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄慧玲，王辰，范维佳，莫丽冬，徐丽霞，仝慧慧，齐浩铭，
申请(专利权)人：天津市环湖医院天津市神经外科研究所，天津市脑系科中心医院，
类型：发明
国别省市：天津,12
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