一种甄别样品间与独立样品自身交叉反应的免疫组库方法技术

本发明专利技术涉及一种甄别样品间与独立样品自身交叉反应的免疫组库方法，其特征在于：利用RACE的原理使得RNA在进行逆转录成cDNA的时候进行模板转换，在PCR扩增前进行2次预扩增，第一次预扩增使得原来的模板的5`端带上了UMI，第二次预扩增使得模板的3`端带上了UMI，再以此带有双端UMI的产物作为模板进行PCR扩增，同时使用的上下游引物均设计Barcode进行标记PCR扩增，最终得到的产物经过纯化并连接上测序接头序列得到最终的测序文库，本方法实现了对每一条序列的独立标记，可以解决样品内相似序列在PCR扩增反应时产生的交叉反应问题，对于不同细胞受体来源的样品，在PCR扩增时均能实现只使用一对引物进行PCR扩增，实现等效扩增，解决了因多重引物扩增而产生的引物偏好性问题，解决了多个样品同时进行文库构建时出现的样品间的交叉反应的问题。

An Immunohistochemical Library Method for Screening Cross-reactions between Samples and Independent Samples

【技术实现步骤摘要】
一种甄别样品间与独立样品自身交叉反应的免疫组库方法
本专利技术属于生物医药服务领域，尤其是涉及一种人免疫组库的PCR扩增，文库构建及在下一代测序中的应用,特别是一种甄别样品间与独立样品自身交叉反应的免疫组库方法。
技术介绍
免疫系统通过免疫B细胞和T细胞的表面受体介导，与病原体或病原体衍生的抗原结合，进而发挥免疫功能保护机体不受侵害。BCR免疫球蛋白重链(IGH)和TCRβ链(TCRB)通过V基因，D基因和J基因区段的重排以产生组合多样性。在V-D和D-J之间的连接处，缺失核苷酸并随机添加核苷酸序列产生了受体连接的多样性。而抗体免疫所产生的轻链，免疫球蛋白λ或κ(IGL/K)和T细胞免疫中的T细胞受体α(TCRA)具有类似地重排，从而形成了免疫系统的多样性。以抗体免疫组库为例，由免疫组库B细胞产生的抗体呈Y型结构，由两条相同的重链和轻链组成。V(D)J重组时，多个V、D、J段中各有一个会被选中并发生重组，形成一个重链的可变区。而最前端的V段的上游，包括ATG在内的序列称为抗体的引导区。每个不同的V基因段对应不同的引导区序列，该序列是抗体组库扩增时5`端引物的靶向区域(如说明书附图1所示)。同理，我们通过对T细胞表面受体结构中的研究，找到了TCR受体序列的引导区，作为TCR序列5`端引物设计的靶点区域。使用高通量测序技术来对由血液或淋巴器官中的免疫组库的分析，已经以极快的速度发展并且正在增加我们对免疫应答的认知。例如对免疫球蛋白基因高通量DNA测序获得的信息可用于高灵敏度地检测B细胞恶性肿瘤，发现对目标抗原特异的抗体，指导疫苗开发和了解自身免疫等。因此，使用高通量测序分析方法对免疫组库的研究，可以促进我们对免疫学的理解以及解决与传染病相关的未满足临床需求的方法，免疫失调和癌症。目前，现有的人免疫组库PCR扩增及文库构建技术主要有两种。1.基于多重PCR的文库构建方法:以DNA或cDNA为模板，针对引导区设计多条上游引物，针对不同的抗体表型在恒定区设计一条下游引物，扩增时使用多对一的引物组合进行扩增，再进行文库构建并测序。2.基于5`RACE的文库构建方法:以mRNA为模板，使用oligodT进行cDNA的全长合成，针对mRNA的5`端的特殊结构，在cDNA的合成同时会在5`端引入一段通用序列，然后使用通用的序列作为上游引物，并在恒定区设计一条下游引物，使用一对引物进行扩增，最后进行文库构建并测序。虽然下一代测序技术能快速的高通量的对免疫组库进行全景式扫描，但是目前的两种方法仍存在较为明显的不足。1.多重PCR方法使用了多种引物，反应体系异常复杂；多重引物设计只能根据已知的参考序列进行设计，不能完全捕捉全人的免疫组库中所有的等位基因；多引物反应无法做到等效扩增，不同引物之间的扩增效率不同导致了PCR偏好性的存在，使结果与真实情况存在较大差异。2.单纯的5`RACE方法虽然能做到等效扩增，但是在建库的时候不能区分来自独立样本内序列的交叉反应。3.现有的测序分析方法与实验技术并没有减轻由PCR后期所产生的嵌合体序列产物而带来的影响，而这些产物在两种扩增方法中均会存在，并对样本内的多样性定量分析产生了极大的干扰，且现有的技术与分析方法并不能甄别大多数的交叉产物序列，会对我们的样本序列产生干扰，产生样本间的序列误差。本申请针对目前的问题进行全新的PCR方法设计，能解决目前遇到的问题，到达真正还原免疫组库真实情况的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于甄别人免疫组库PCR扩增与文库构建的过程中产生的样品间及样品内相似序列的交叉反应，从而能真实的还原免疫组库的真实情况，在完成PCR扩增后可以把多个样品或样品间合并构建一个文库，解决样品内相似序列在PCR扩增反应时产生的交叉反应问题，对于不同细胞受体来源的样品，在PCR扩增时使用的上下游引物均设计由4-12个不同碱基组成的Barcode进行标记，解决了多个样品同时进行文库构建时出现的样品间的交叉反应的问题。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同意义。术语：UMI全称为uniquemolecularidentifiers，由随机碱基组成，本专利技术设计的UMI的结构为N(10)结构，长度为10bp，其随机数目为410个，具有极好的随机性；Barcode：条形码，这里指4-12bp组成的已知的特定序列。5`RACE：5`RapidAmplificationofcDNAEnds，cDNA5端快速扩增。本专利技术是基因5'RACE的原理，在PCR扩增前进行两次一轮的预扩增，使得每条cDNA的两端都标记上不同的且唯一的UMI序列，在PCR扩增时使用的上下游引物均设计由4-12个不同碱基组成的Barcode进行标记，可以把多个样品合出现并构建一个文库。一种甄别样品间与独立样品自身交叉反应的免疫组库方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、cDNA模板制备：以大于10ng的RNA为起始量，利用RACE的原理使得RNA在进行逆转录成cDNA的时候进行模板转换成cDNA；S2、接着cDNA模板在PCR扩增前进行2次预扩增，第一次预扩增使用带UMI的上游引物，使得原来的模板的5`端带上了UMI，形成产物A；S3、把产物A进行第二次预扩增，使用带UMI的下游引物，使得模板的3`端带上了UMI，形成产物B；S4、再以步骤S3中的带有双端UMI的产物B作为模板，再使用双端Barcode引物进行PCR扩增，最后得到产物C；S5、步骤S4中得到的最终产物C经过纯化并连接测序接头序列得到最终的测序文库。所述的步骤S1、S2、S3、S4中，第一次预扩增的上游引物、第二次预扩增的下游引物及PCR扩增的引物序列共104条，如序列表所示。所述的S1的cDNA模板制备包括以下：(1)细胞RNA提取：细胞来源包括但不限于人或小鼠、大鼠及兔子的外周血分离得到的淋巴细胞，细胞个数为大于100个，加入细胞裂解液进行裂解，使用RNA提取试剂盒进行RNA的抽提；(2)组织RNA提取：组织来源包括但不限于人手术下来的肿瘤组织与正常组织或来源于小鼠、大鼠及兔子的各种组织类型，起始量为大于1mg，采用液氮研磨后加入裂解液进行裂解，使用RNA提取试剂盒进行RNA的抽提；(3)对mRNA进行质量鉴定及浓度检测，要求mRNA的结果完整，RNA总量大于10ng；(4)为了提高cDNA的产量，我们在合成cDNA是做了前期优化处理，按照如下表配置混合体系，并在PCR仪上进行反应，反应程序为：70℃，1min，反应程序结束后立马把产物放于冰上3min；(5)配置下表的混合体系，与步骤(4)的产物混合后放在PCR仪上进行反应，反应程序为：42℃，90min，75℃，15min，4℃，∞。反应后的产物即为合成好的cDNA模板，将用于下一步实验；所述的S2的cDNA模板第一预扩增条件包括以下：(1)配置如下表的PCR反应体系；(2)PCR反应程序如下表：(3)反应完成后，对反应产物进行纯化，最后用20ulNuclease-freewater进行洗脱，得到产物A。所述的S3的产物A进行第二预扩增条件包括以下：(1)配置如下表的PCR反应体系，把产物A分成4等份，同时进行4个反应；(2)PCR反应程序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甄别样品间与独立样品自身交叉反应的免疫组库方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、cDNA模板制备：以大于10ng的RNA为起始量，利用RACE的原理使得RNA在进行逆转录成cDNA的时候进行模板转换成带一段固定接头的cDNA；S2、接着cDNA模板在PCR扩增前进行2次预扩增，第一次预扩增使用带UMI的上游引物，使得原来的模板的5`端带上了UMI，形成产物A；S3、经纯化后，把产物A进行第二次预扩增，使用带UMI的下游引物，使得模板的3`端带上了UMI，形成产物B；S4、经纯化后，以步骤S3中的带有双端UMI的产物B作为模板，再使用双端Barcode引物进行PCR扩增，最后得到产物C；S5、步骤S4中得到的最终产物C经过纯化并连接测序接头序列得到最终的测序文库。

【技术特征摘要】
1.一种甄别样品间与独立样品自身交叉反应的免疫组库方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、cDNA模板制备：以大于10ng的RNA为起始量，利用RACE的原理使得RNA在进行逆转录成cDNA的时候进行模板转换成带一段固定接头的cDNA；S2、接着cDNA模板在PCR扩增前进行2次预扩增，第一次预扩增使用带UMI的上游引物，使得原来的模板的5`端带上了UMI，形成产物A；S3、经纯化后，把产物A进行第二次预扩增，使用带UMI的下游引物，使得模板的3`端带上了UMI，形成产物B；S4、经纯化后，以步骤S3中的带有双端UMI的产物B作为模板，再使用双端Barcode引物进行PCR扩增，最后得到产物C；S5、步骤S4中得到的最终产物C经过纯化并连接测序接头序列得到最终的测序文库。2.根据权利要求1所述的一种制备权利要求1所述的一种甄别独立样品自身交叉反应的免疫组库方法，其特征在于：所述的步骤S1、S2、S3、S4中，第一次预扩增的上游引物、第二次预扩增的下游引物及PCR扩增的引物序列共104条，如序列表所示。3.根据权利要求1所述的一种制备权利要求1所述的一种甄别独立样品自身交叉反应的免疫组库方法，其特征在于，所述的S1的cDNA模板制备包括以下：(1)细胞RNA提取：细胞来源包括但不限于人或小鼠、大鼠及兔子的外周血分离得到的淋巴细胞，细胞个数为大于100个，加入细胞裂解液进行裂解，使用RNA提取试剂盒进行RNA的抽提；(2)组织RNA提取：组织来源包括但不限于人手术下来的肿瘤组织与正常组织或来源于小鼠、大鼠及兔子的各种组织类型，起始量为大于1mg，采用液氮研磨后加入裂解液进行裂解，使用RNA提取试剂盒进行RNA的抽提；(3)对mRNA进行质量鉴定及浓度检测，要求mRNA的结果完整，RNA总量大于10ng；(4)为了提高cDNA的产量，我们在合成cDNA是做了前期优化处理，按照如下表配置混合体系，并在PCR仪上进行反应，反应程序为：70℃，1min，反应程序结束后立马把产物放于冰上3min；(5)配置下表的混合体系，与步骤(4)的产物混合后放在PCR仪上进行反应，反应程序为：42℃，90min，75℃，15min，4℃，∞。反应后的产物即为合成好的cDNA模板，将用于下一步实验；4.根据权利要求2所述的一种制备权利要求1所述的一种甄别独立样品自身交叉反应的免疫组库方法，其特征在于：所述的S2的cDNA模板第一预扩增条件包括以下：(1)配置如下表的PCR反应体系；(2)PCR反应程序如下表：(3)反应完成后，对反应产物进行纯化，最后用20ulNuclease-freewater进行洗脱，得到产物A。5.根据权利要求2所述的一种制备权利要求1所述的一种甄别独立样品自身交叉反应的免疫组库方法，其特征在于：所述的S3的产物A进行第二预扩增条件包括以下：(1)配置如下表的PCR反应体系，把产物A分成4等份，同时进行4个反应；(2)PCR反应程序如下表：(3)反应完成后，把4个反应得到的产物混合得到一个总管合计200ul的产物，对该产物进行纯化，最后用20ulNuclease-freewater进行洗脱，得到产物B。6.根据权利要求2所述的一种制备权利要求1所述的一种甄别独立样品自身交叉反应的免疫组库方法，其特征在于：使用双端Barcode引物进行PCR扩增，包括以下：(1)以步骤S3纯化好的产物B为模板进行PCR反应，按照下表配制反应体系；(2)PCR反应程序如下表：(3)反应完成后，对该产物进行纯化，最后用30ulNuclease-freewater进行洗脱，得到产物C。7.根据权利要求3、4、5或6所述的一种制备权利要求1所述的一种甄别独立样品自身交叉反应的免疫组库方法，其特征在于：所述引物序列要求如下：RACEoligo的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:1组成，其中末端的4个G为核糖核酸中的鸟嘌呤；步骤2中的Primer1的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:2组成；当受体为人BCRIgA重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:3组成；当受体为人BCRIgD重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:4组成；当受体为人BCRIgE重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:5组成；当受体为人BCRIgG重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:6组成；当受体为人BCRIgM重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:7组成；当受体为人BCRIgK轻链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:8组成；当受体为人BCRIgL轻链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:9组成；当受体为人TCRalpha链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:10组成；当受体为人TCRbeta链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:11组成；当受体为人TCRdelta链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:12组成；当受体为人TCRgama链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:13组成；当受体为小鼠BCRIgA重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:14组成；当受体为小鼠BCRIgD重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:15组成；当受体为小鼠BCRIgE重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:16组成；当受体为小鼠BCRIgG重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:17组成；当受体为小鼠BCRIgM重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:18组成；当受体为小鼠BCRIgK轻链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:19组成；当受体为小鼠BCRIgL轻链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:20组成；当受体为小鼠TCRalpha链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:21组成；当受体为小鼠TCRbeta链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:22组成；当受体为小鼠TCRdelta链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:23组成；当受体为大鼠BCRIgA重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:24组成；当受体为大鼠BCRIgD重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:25组成；当受体为大鼠BCRIgE重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:26组成；当受体为大鼠BCRIgG重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:27组成；当受体为大鼠BCRIgM重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:28组成；当受体为大鼠BCRIgK轻链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:29组成；当受体为大鼠BCRIgL轻链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:30组成；当受体为兔子BCRIgA重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:31组成；当受体为兔子BCRIgE重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:32组成；当受体为兔子BCRIgG重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:33组成；当受体为兔子BCRIgM重链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:34组成；当受体为兔子BCRIgK轻链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:35组成；当受体为兔子BCRIgL轻链时：步骤3中的Primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:36组成；当受体为人BCRIgA重链时：步骤4中的Primer3的核苷酸序列包含或由SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：张镇海，何奖图，蓝春红，王敏惠，朱燕，李丽敏，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东,44